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La cromatografia ionica (IC) è una tecnica analitica utilizzata per separare e quantificare analiti ionici e polari. L' IC è stata ampiamente accettata dall'industria farmaceutica e dagli organismi di regolamentazione per una gamma più ampia di applicazioni come la qualità dell'acqua e l'analisi chimica. Negli ultimi anni si è qualificata per analizzare i prodotti farmaceutici. United States Pharmacopeia-National Formulary (USP-NF, US Pharmacopeia (USP)), l'organismo di standardizzazione dei prodotti (bio)farmaceutici, ha aumentato il potenziale dell'IC durante i suoi approcci di modernizzazione, affermandola come una tecnica appropriata e valida nei loro General Chapters, saggi e test di impurità.

Questo articolo introduce brevemente i principi della cromatografia ionica, quindi discute le applicazioni e i vantaggi del suo utilizzo per l'analisi farmaceutica sulla base della USP General Chapter <1065> Ion Chromatography.

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Cos'è la cromatografia ionica?

ILa cromatografia ionica è un tipo di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzata per separare e quantificare simultaneamente analiti ionici e polari, molto spesso utilizzando lo scambio ionico come meccanismo di separazione [1–3] (Animazione 1). 

Animazione 1. Principio della cromatografia a scambio ionico. Gli ioni si legano alla superficie caricata in modo opposto delle particelle della colonna e vengono eluiti dalla superficie quando scorre l'eluente ionico. La separazione degli analiti dipende dal rapporto carica/dimensione, ad esempio le specie monovalenti eluiranno più velocemente delle specie di- o multivalenti. Nella cromatografia ionica, l'eluente e gli analiti hanno proprietà chimiche simili. Maggiore è la concentrazione dell'eluente, minori saranno i tempi di ritenzione degli analiti.

La combinazione di colonne di separazione a scambio ionico e rilevamento della conducibilità rappresenta la maggior parte delle applicazioni di IC, ma è comune anche l'utilizzo di altre tecniche di rilevamento come UV/VIS, rilevamento amperometrico o sillabazione con spettrometri di massa [3,4]. I componenti principali di una configurazione per cromatografia liquida sono mostrati nella Figura 1. Questi includono una pompa ad alta pressione con stoccaggio della fase mobile (eluente), un iniettore (introduzione del campione), una colonna di separazione (colonna analitica) e il sistema di rilevamento (inclusa derivatizzazione, acquisizione ed elaborazione dati).

Figure 1. Schema di un impianto di cromatografia liquida modificato da USP General Chapter <1065> [3].

Scopri di più sullo sviluppo della cromatografia ionica di Metrohm e sulle sue numerose tecniche di rilevamento con questi materiali correlati.

Blog post: Storia di Metrohm IC – Parte 1

Monografia: Cromatografia Ionica

Monografia: Cromatografia ionica pratica: un'introduzione

Perché la cromatografia ionica è importante per l’industria farmaceutica?

Anche se gli approcci HPLC dominano i metodi di cromatografia liquida nell’industria farmaceutica, anche l’IC è stato ampiamente accettato. I vantaggi dell'IC rispetto ad altri metodi cromatografici liquidi o tradizionali come la titolazione per l'industria farmaceutica possono essere riassunti come segue[5,6]:

  • analisi di più analiti in un'unica analisi
  • dedicato agli analiti ionici e polari
  • percorso del flusso privo di metalli
  • gli eluenti sono basati su sali, acidi deboli o basi deboli
  • ssoppressione (Animazione 2) per linea di base bassa e rapporto segnale-rumore basso, migliorando la sensibilità analitica
  • strumentazione flessibile: vari rilevatori (ad esempio conduttività, UV/VIS, rilevamento amperometrico o sillabazione con spettrometri di massa), un elevato grado di automazione fo massima efficienza e basso costo (e.g., opzioni Inline sample preparation o calibrazione a singolo standard) 

Animazione 2. IC: la soluzione definitiva per le tue sfide analitiche.

IC come approccio validato per gli standard USP-NF

Essendo uno degli organismi trainanti per la standardizzazione dei metodi farmaceutici, l'USP-NF garantisce la qualità, la sicurezza e l'efficacia dei prodotti farmaceutici all'interno del processo di produzione e del loro utilizzo [6,7]. La storia degli standard USP-NF è piuttosto lunga: oltre 200 anni [6]. Tuttavia, nuovi criteri di qualità e tecnologie hanno supportato un’iniziativa di modernizzazione globale della FDA (U.S. Food and Drug Administration) e dell’USP-NF nel 2010.

L'IC, come approccio metodologico per l'analisi di impurità in tracce, eccipienti, ingredienti farmaceutici attivi (API), metaboliti e prodotti di degradazione e componenti ionici in soluzioni farmaceutiche e fluidi corporei [5,8–15], è diventato un approccio convalidato in numerose USP capitoli, saggi, impurità e test di identificazione. In questo caso, l’IC ha parzialmente sostituito i metodi tradizionali (ad esempio, la titolazione) o è stato incluso in nuovi standard incentrati sull’utilizzo di metodi all’avanguardia del settore.

I fondamenti delle tecniche cromatografiche sono forniti nell' USP General Chapters <621> and <1065> [16,17]. Questi capitoli generali descrivono i dettagli sulla metodologia e la configurazione generale, nonché i parametri chiave e i requisiti per l'accuratezza e l'affidabilità dei metodi cromatografici nelle analisi farmaceutiche. 

USP General Chapters <621> e <1065>: principi fondamentali e fondamenti per la cromatografia

USP General Chapter <621> fornisce una panoramica di diverse tecniche cromatografiche insieme alle definizioni dell'apparato e della procedura (ad esempio, fase mobile, colonna, tipi di eluizione, procedura del metodo), parametri comuni e requisiti per i test di idoneità del sistema (ad esempio, sistema ripetibilità, sensibilità del sistema e prestazioni di picco) [16]. La classificazione delle colonne cromatografiche viene spiegata anche con un elenco di impaccamenti (numeri L), fasi (G) e supporti (S), che funzionano come riferimenti per i cromatografi [18].
 

I numeri L di cromatografia ionica per gli approcci USP e approfondimenti sulla procedura di equivalenza delle colonne sono spiegati nell'articolo seguente.

Blog post: Applicazione di metodi validati USP per l'equivalenza delle colonne di separazione


D'altra parte, USP General Chapter <1065> fornisce una panoramica completa dell'IC [16,17] e della sua importanza come procedura di test riconosciuta per identificare e quantificare analiti specifici (test e impurezze). La cromatografia ionica è una procedura di caratterizzazione valida in molte circostanze e si allinea con tutti gli aspetti della produzione farmaceutica [8,17]. Il suo campo di applicazione è ampio e comprende il controllo di qualità di materie prime, sostanze farmaceutiche o prodotti formulati, nonché la valutazione delle acque di processo utilizzate per la produzione, terreni di coltura, soluzioni detergenti o flussi di acque reflue [17]. USP <1065> comprende le conoscenze di base di questa tecnica: cos'è la cromatografia ionica, i dettagli della strumentazione (Figura 1), i meccanismi di rilevamento comuni, le procedure e le note importanti per lo sviluppo del metodo appropriato.

Spiegazioni più estese dei criteri e dei requisiti per la validazione del metodo sono collegate al General Chapter <1225> Validation of Compendial Procedures. Ciò include test di idoneità del sistema per garantire che il sistema IC funzioni correttamente prima dell'analisi valutando parametri tra cui risoluzione, tempo di ritenzione e forma del picco, nonché requisiti per la convalida con parametri chiave come linearità, accuratezza, precisione, specificità, limite di rilevamento ( LOD) e limite di quantificazione (LOQ) [19]. In generale, quando si sviluppa un metodo IC, è molto importante selezionare fasi mobili e stazionarie appropriate (Figura 1) per garantire una separazione efficiente e un'adeguata selettività e sensibilità (requisiti secondo USP <1225>) [17,19]. Le fasi mobili sono tipicamente costituite da acidi, basi o sali diluiti disciolti in acqua ad elevata purezza, mentre le fasi stazionarie possono essere materiali a base di silice o polimeri.

Per la loro importanza, colonne e apposite fasi mobili sono inserite nelle monografie e nei capitoli generali dell'USP. Tuttavia, l'equivalenza delle colonne offre agli utenti una certa libertà nell'implementazione del metodo nel flusso di lavoro analitico.



Scopri di più sulle colonne IC nella nostra serie di post sul blog, a partire da qui.

Blog post: Best practice per le colonne di separazione nella cromatografia ionica (IC) – Parte 1

Tecniche di rilevamento IC e applicazioni secondo USP <1065>

In questa sezione vengono discussi quattro metodi di rilevamento IC comunemente utilizzati (clicca di seguito per passare a un argomento):

Rilevazione della conduttività

Il metodo di rilevamento IC più comune è la conduttività [17]. Il principio, basato sulla conduttometria, è mostrato nell'Animazione 3 [2]. Il rilevamento della conduttività misura la capacità degli ioni in una soluzione di condurre la corrente elettrica tra due elettrodi, fornendo informazioni sulla concentrazione delle specie ioniche presenti. Se combinato con un soppressore, il segnale di fondo viene ridotto e la sensibilità e il rapporto segnale-rumore vengono notevolmente migliorati (Animazione 2) [2,17].

Animazione 3. Il principio del rilevamento della conduttività per la cromatografia ionica è mostrato in questo video.

Il circuito integrato con rilevamento della conduttività ha un'ampia gamma di applicazioni per l'analisi farmaceutica, tra cui:

Applicazione Analita Matrice Metrohm Application Note
Anioni fluoruro sale di fluoruro di sodio AN-S-375
dentifricio in gel al fluoruro di sodio AN-S-376
compresse di fluoruro di sodio AN-S-379
monofluorofosfato di sodio (Na2PFO3) AN-S-380
soluzione topica per l'igiene dentale con fluoruro di sodio AN-S-399
cloruro compresse effervescenti di potassio bicarbonato e potassio cloruro per sospensione orale AN-S-373
fosfato iniezioni composte di fosfati di sodio e potassio AN-S-398
Cationi calcio e magnesio Compresse di carbonato di calcio e magnesio; compresse masticabili di carbonato di calcio e magnesia AN-C-194
sodio iniezioni composte di bicarbonato di sodio e fosfati di sodio AN-CS-021
potassio tartrato acido di potassio (bitartrato di potassio) AN-C-181
Molecole complesse N-metilpirrolidone (NMP) cefepima cloridrato AN-C-111

La particolarità dell'IC risiede nella determinazione di più analiti in un'unica analisi, come mostrato, ad esempio, per più analiti anionici (acetato, cloruro, citrato e solfato in una soluzione per infusione; AN-N-051) o per componenti cationici (sodio, potassio, calcio e magnesio nella formula di somministrazione a goccia; AN-C-022). Grazie alle colonne IC ad alta capacità, la separazione degli analiti è possibile anche nelle matrici più resistenti [7].

Rilevazione UV/VIS

UV/VIS – una tecnica di rilevamento ottico che può essere utilizzata direttamente, indirettamente, o con derivatizzazione post-column – è utile per rilevare gli ioni che assorbono la luce UV/VIS [2,17].

Il rilevamento diretto UV-VIS viene utilizzato insieme al rilevamento della conducibilità, ad esempio per la determinazione di ioni che assorbono fortemente nella gamma UV (nitriti, nitrati, anioni organici) per migliorarne la rilevabilità in presenza di elevate concentrazioni di ioni inorganici (cloruro, fosfato , solfato) che hanno nessuna o solo scarsa capacità di assorbimento dei raggi UV [2]. Il principio di questo metodo di rilevamento è mostrato nell'Animazione 4.

Animazione 4. Il principio del rilevamento UV/VIS per la cromatografia ionica è mostrato in questo video.
Chromatogram for nitrite determination with UV/VIS detection in a hydroxypropyl methylcellulose sample. Separation was performed on a Metrosep A Supp 10 column. To improve sensitivity, the Metrohm intelligent Preconcentration Technique with Matrix Elimination (MiPCT-ME) was used.
Figure 2. Cromatogramma per la determinazione dei nitriti con rilevamento UV/VIS in un campione di idrossipropilmetilcellulosa. La separazione è stata eseguita su una colonna Metrosep A Supp 10. Per migliorare la sensibilità, è stata utilizzata la tecnica di preconcentrazione intelligente Metrohm con eliminazione della matrice (MiPCT-ME).

L'esempio in Figura 2 (AN-S-402) mostra la determinazione del nitrito nell'idrossipropilmetilcellulosa secondo USP <621>. L'analisi dei nitriti è di grande importanza durante la produzione farmaceutica per prevenire la formazione di nitrosammine cancerogene. Anche se il nitrito può essere rilevato in modo affidabile con conduttività (ad esempio, nei sali di nitrito di sodio, AN-S-400),  il rilevamento UV/VIS diretto a 215 nm è il metodo preferito per l'analisi a livello di tracce.

Per rilevamento UV indiretto, vengono utilizzati eluenti con elevata assorbanza nella regione spettrale visibile o ultravioletta (ad esempio, tamponi ftalati) [17]. La lunghezza d'onda di rilevamento è selezionata in modo tale che l'eluente assorba, ma gli ioni del campione no. Questa scelta comporta picchi negativi proporzionali alla concentrazione dell'analita.

Determination of zinc in a zinc oxide sample as per USP General Chapter <591> using a 930 Compact IC Flex with UV/VIS detection (947 Professional UV/VIS Detector Vario). A stationary phase L91 packing was used (Metrosep A Supp 10) with a PDCA mobile phase, fulfilling all USP requirements. Samples were automatically introduced with an 889 IC Sample Center – cool.
Figure 3. Determinazione dello zinco in un campione di ossido di zinco secondo il capitolo generale USP <591> utilizzando un Compact IC Flex 930 con rilevamento UV/VIS (947 Professional UV/VIS Detector Vario). È stato utilizzato un impaccamento della fase stazionaria L91 (Metrosep A Supp 10) con una fase mobile PDCA, soddisfacendo tutti i requisiti USP. I campioni sono stati introdotti automaticamente con un 889 IC Sample Center: fantastico.

Durante il rilevamento UV/VIS dopo la reazione post-colonna, gli analiti vengono rilevati dopo che l'effluente della colonna è stato combinato con un reagente, formando un composto che assorbe la luce alle lunghezze d'onda UV o visibili. Il rilevamento UV-VIS con derivatizzazione post-colonna viene utilizzato principalmente per rilevare metalli di transizione come ferro, nichel, rame, manganese o zinco (AN-U-076, Figura 3).

Rilevazione amperometrica

Il rilevamento amperometrico è un metodo analitico elettrochimico in cui la corrente generata dall'ossidazione o dalla riduzione degli analiti su un elettrodo di lavoro viene misurata in funzione del tempo [20] (Animazione 5). 

Animazione 5. Il principio della rilevazione amperometrica è mostrato in questo video.

Un prerequisito è che gli ioni bersaglio devono poter essere ridotti o ossidati, cioè sostanze elettroattive [2,17]. Analiti di esempio sono composti organici, metalli di transizione, anioni (ad esempio nitrito, nitrato, solfuro, solfito) o carboidrati [2]. Alcuni esempi di utilizzo dell'IC con rilevamento amperometrico per l'industria farmaceutica includono lattosio (nei latticini e negli integratori, AN-P-089), catecolamine (in una soluzione farmaceutica iniettabile, AN-P-053), gentamicina (nella soluzione di gentamicina, AN-P-080), e glicole propilenico (nella soluzione topica di diclofenac, AN-P-076).

Il nostro White Paper descrive la determinazione del poliribosilribitol fosfato (PRP) in un vaccino Haemophilus influenzae utilizzando IC con rilevamento amperometrico pulsato (Figura 4).

Figure 4. Determinazione del contenuto di poliribosilribitol fosfato (PRP) in un campione di vaccino tramite IC. La separazione è stata eseguita su una colonna a scambio anionico utilizzando un eluente acetato di sodio-idrossido di sodio seguito da rilevamento amperometrico pulsato utilizzando un elettrodo di lavoro in oro e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.

La linea nera nel cromatogramma mostra uno standard con una concentrazione di 3 µg/mL di PRP. La linea blu-verde indica il contenuto totale di PRP (concentrazione finale 19,42 mg/L), entro l'80–120% dell'etichetta dichiarata (16–24 mg/L). Secondo i criteri di qualità, il PRP libero deve essere inferiore al 20% del contenuto totale di PRP. Il campione (linea verde lime nel cromatogramma) mostra il contenuto di PRP libero determinato (concentrazione finale di 2,03 mg/l) e rientra nei requisiti.

IC combinata con la spettrometria di massa


La cromatografia ionica può essere combinata con spettrometri di massa per migliorare la sensibilità di rilevamento di acidi organici, carboidrati o oligoelementi. La strumentazione inerte garantisce flessibilità per quanto riguarda la fase mobile utilizzata e protegge dalla contaminazione, che è particolarmente importante per la speciazione degli oligoelementi. La tecnica di soppressione del circuito integrato garantisce che il liquido che entra in questi spettrometri di massa altamente sensibili contenga solo analiti e acqua (e forse alcuni modificatori organici). Ciò è vantaggioso per condizioni di funzionamento stabili, sensibilità dell’analisi e prolungamento della durata dello strumento.

Scopri di più sulla combinazione di IC con SM con le nostre risorse qui.

Combinazione della cromatografia ionica e della spettrometria di massa

White Paper:Un'introduzione alla spettrometria di massa con cromatografia ionica (IC-MS)

Conclusione

La cromatografia ionica è uno strumento analitico potente e versatile per applicazioni farmaceutiche. È in grado di gestire un'ampia varietà di tipi di campioni e fornisce un'elevata sensibilità nel rilevamento di sostanze ioniche e ionizzabili. La capacità del circuito integrato di accoppiare diverse strategie di rilevamento lo rende prezioso nella produzione farmaceutica e nel controllo di qualità.

[1] Weiss, J.; Shpigun, O. Handbook of Ion Chromatography, 4th ed.; Wiley-VCH: Hoboken, New Jersey, USA, 2016; Vol. 3.

[2] Schäfer, H.; Läubli, M. Monograph Ion Chromatography; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.

[3] Kolb, M.; Seubert, A.; Schäfer, H.; Läubli, M. (Editor). Monograph: Practical Ion Chromatography, 3rd ed.; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2020.

[4] Seubert, A.; Frenzel, W.; Schäfer, H.; et al. Monograph: Advanced Detection Techniques in Ion Chromatography; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2016.

[5] Kappes, S. When HPLC Fails: IC in Food, Water, and Pharmaceutical Analysis. White paper, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2019, 11.

[6] Klein, M. USP Monograph Modernization Initiative Leading to Modern Ion Chromatography-Based Methods. White paper, WP-092EN–2023-11, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2023, 8.

[7] Süss, E. Advancing Pharmaceutical Analysis with Ion Chromatography. Column 2024, 20 (8), 9–16.

[8] Kappes, S.; Steinbach, A.; Ruth, K. IC: The All-Rounder in Pharmaceutical Analysis. White paper, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2017, 6.

[9] Metrohm AG. Pharmaceutical Analysis: Quality Control of Pharmaceuticals. Brochure, 8.000.5139EN – 2015-09, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2015, 40.

[10] Subramanian, N. H.; Wille, A. Inline Sample Preparation – An Effective Tool for Ion Analysis in Pharmaceutical Products. Metrohm AG, 8.000.6010.

[11] Metrohm AG. Bring Your USP Methods up to Date! - The Benefits of Metrohm Ion Chromatography for Your Analytics of APIs, Impurities, and Excipients. Brochure, 8.000.5436EN – 2023-05, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2023, 3.

[12] Jenke, D. Application of Ion Chromatography in Pharmaceutical and Drug Analysis. Journal of Chromatographic Science 2001, 49 (7), 524–539. DOI:10.1093/chrsci/49.7.524

[13] Metrohm AG. Quality Control of Dialysis Concentrates - Comprehensive Analysis of Anions, Acetate, and Cations by IC; Application Note, AN-D-003-2022-08; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2022.

[14] Metrohm AG. Qualitative Determination of Anions in Urine to Verify Adulteration; Application Note, AN-S-215, 2005; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2005.

[15] Metrohm AG. Mannitol, Rhamnose, Lactulose and Lactose in Blood Serum with Pulsed Amperometric Detection (PAD); Application Note, AN-P-063, 2016; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2016.

[16] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <621> Chromatography; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

[17] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <1065> Ion Chromatography; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M897_01_01

[18] U. S. Pharmacopeia. Chromatographic Columns; USP: Rockville, MD, USA, 2023.

[19] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <1225> Validation of Compendial Procedures; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[20] D. Rocklin, R. Detection in Ion Chromatography. Journal of Chromatography A 1991, 546, 175–187. DOI:10.1016/S0021-9673(01)93016-X

La tua conoscenza "take-aways"

Monografie sui farmaci, test e valutazioni delle impurità: aggiorna i tuoi metodi USP con la cromatografia ionica Metrohm

Flyer: Aggiorna i tuoi metodi USP!

Blog post: Applicazione di metodi validati USP per l'equivalenza delle colonne di separazione

White Paper: Quando l'HPLC fallisce: IC nelle analisi di alimenti, acqua e prodotti farmaceuticihe

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Webinar on-demand: Cromatografia ionica per applicazioni farmaceutiche

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Autore
Süss

Dr. Elke Süss

Application Specialist Ion Chromatography
Metrohm International Headquarters, Herisau, Switzerland

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