Ионная хроматография для фармацевтической промышленности

Ионная хроматография (ИХ) — это аналитический метод, используемый для разделения и количественного определения ионных и полярных аналитов. Ионная хроматография получила широкое распространение для анализа химического состава и качества воды в фармацевтической промышленности и регулирующих её органах. В последние годы метод ИХ получил квалификацию для анализа фармацевтических препаратов. Фармакопея США, The United States Pharmacopeia-National Formulary (USP-NF, US Pharmacopeia (USP)), ведущий орган по стандартизации (био)фармацевтической продукции, повысил возможности ионной хроматографии, включив его в свой справочник "General Chapters, assays, and impurity tests".

В этой статье кратко излагаются принципы ионной хроматографии,  области применения и преимущества ее использования для фармацевтического анализа на основе USP General Chapter <1065> Ion Chromatography.

Нажмите, чтобы перейти непосредственно к теме:

• Что такое ионная хроматография? 
• Почему ионная хроматография важна для фармацевтической промышленности?
• Методы детектирования в ИХ и их применение согласно USP <1065>

Что такое ионная хроматография?

Ионная хроматография — это метод, представляющий собой разновидность высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используемый для одновременного разделения и количественного определения ионных и полярных аналитов, чаще всего с использованием ионного обмена в качестве механизма разделения [1–3] (Анимация 1). 

В большинстве методик ИХ используется сочетание ионообменных разделительных колонок и кондуктометрического детектора, но также распространены и другие методы детектирования, такие как UV/VIS (УФ/ВИД), амперометрическое детектирование или комбинирование с масс-спектрометрами [3,4]. Основные компоненты установки жидкостной хроматографии показаны на Рисунке 1. К ним относятся насос высокого давления с накопителем подвижной фазы (элюента), инжектор (ввод образца), разделительная колонка (аналитическая колонка) и система обнаружения (включая дериватизацию, сбор данных и обработку данных). 

Узнайте больше о разработках ионной хроматографии в Metrohm и ее многочисленных методах обнаружения.

Блог Metrohm: История Metrohm IC – Часть 1

Монография: Ионная хроматография

Монография: Практическая ионная хроматография – Введение

Почему ионная хроматография важна для фармацевтической промышленности?

Несмотря на то, что в фармацевтической промышленности преобладают методы жидкостной хроматографии с использованием ВЭЖХ, метод ИХ также получил широкое распространение. Преимущества ИХ по сравнению с  хроматографическими или другими традиционными методами, такими как титрование, можно обобщить следующим образом [5,6]:

• анализ нескольких аналитов за один запуск
• метод предназначен для ионных и полярных аналитов
• отсутствие металлических элементов в системе 
• элюенты  в виде солей, слабых кислот или слабых оснований
• использование подавления электропроводности элюента (Анимация 2) для низкой базовой линии и низкого отношения сигнал/шум, что улучшает аналитическую чувствительность
• гибкая аппаратура: различные детекторы (например, кондуктометрический, UV/VIS, амперометрический детектор или совмещение с масс-спектрометрами), высокая степень автоматизации для максимальной эффективности (например, встроенные возможности пробоподготовки или калибровки по одному стандарту) 

ИХ как проверенный подход для стандартов USP-NF

Будучи одним из ведущих органов стандартизации фармацевтических методов, USP-NF обеспечивает качество, безопасность и эффективность фармацевтических препаратов в процессе их производства и использования [6,7]. История стандартов USP-NF довольно долгая — более 200 лет [6]. Однако новые критерии качества и технологии поддержали глобальную инициативу модернизации FDA (U.S. Food and Drug Administration) и USP-NF в 2010 году.

ИХ, как методологический подход к анализу следовых примесей, вспомогательных веществ, активных фармацевтических ингредиентов (АФИ), метаболитов и продуктов распада, а также ионных компонентов в фармацевтических растворах и жидкостях организма [5,8–15], стал проверенным подходом в многочисленных главах Фармакопеи США (USP chapters, assays, impurity and identification tests). Здесь ИХ частично заменила традиционные методы (например, титрование) или была включена в новые стандарты, ориентированные на использование современных методов.

Основы хроматографических методов изложены в USP General Chapters <621> and <1065> [16,17]. Там подробно описываются методология и общая схема, а также основные параметры и требования к точности и надежности хроматографических методов фармацевтического анализа. 

USP General Chapters <621> и <1065>: Основные принципы и основы хроматографии

В USP General Chapters <621> дается обзор нескольких хроматографических методов, а также рекомендованных аппаратуры и процедур (например, подвижная фаза, колонка, типы элюирования, методика), общие параметры и требования к тестированию пригодности системы (например, повторяемость, чувствительность и пиковая производительность) [16]. Классификация хроматографических колонок также осуществляется по L-группам, фазам (G) и носителям (S), которые служат справочной информацией для сотрудников лабораторий [18].
 

В статье ниже приведена классификация колонок по L-группам для применений ионной хроматографии согласно USP, а также сведения о эквивалентности колонок.

Блог Metrohm: Применение методов, утвержденных USP, для эквивалентности разделительных колонок

С другой стороны, в USP General Chapter <1065> представлен всесторонний обзор ИХ [16,17] и её важность как признанной процедуры испытаний для идентификации и количественного определения конкретных аналитов (проб и примесей). Ионная хроматография является действенной процедурой анализа и соответствует всем аспектам фармацевтического производства [8,17]. Область её применения широка и включает контроль качества сырья, лекарственных веществ или готовых продуктов, а также оценку технологических вод, используемых в производстве, питательных сред, чистящих растворов, сточных вод [17].  USP <1065> содержит базовые знания о методе ИХ: что такое ионная хроматография, сведения об оборудовании (Рисунок 1), общие механизмы обнаружения, процедуры и важные примечания для разработки соответствующих методов.

Более подробные объяснения критериев и требований к валидации методов приведены в General Chapter <1225> Validation of Compendial Procedures, что включает в себя тестирование пригодности системы путем оценки таких параметров, как разрешение, время удерживания и форма пика, а также требований к валидации с такими ключевыми параметрами, как линейность, точность, специфичность, предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ). Это позволяет убедиться, что ИХ-система функционирует должным образом перед началом анализа [19]. В целом при разработке методов для ИХ крайне важно выбрать соответствующие подвижную и неподвижную фазы (Рисунок 1) для обеспечения эффективного разделения и соответствующей селективности и чувствительности (согласно тебованиям USP <1225>) [17,19]. Подвижные фазы обычно состоят из разбавленных кислот, оснований или солей, растворенных в воде высокой степени очистки, тогда как неподвижные фазы могут быть изготовлены из материалов на основе диоксида кремния или полимеров.

Колонки и соответствующие подвижные фазы включены в монографии и General Chapters of USP. Однако универсальность колонок дает пользователям некоторую свободу при внедрении методов в рабочий процесс. 

Узнайте больше об ИХ колонках в серии публикаций нашего блога:

Блог Metrohm: Лучшие применения разделительных колонок в ионной хроматографии (ИХ) – Часть 1

Методы детектирования и их применение согласно USP <1065>

В этом разделе обсуждаются четыре наиболее часто используемых методов детектирования (нажмите ниже, чтобы перейти к теме):

• кондуктометрическое 
• UV/VIS
• амперометрическое 
• встроенная масс-спектрометрия

Кондуктометрическое детектирование 

Наиболее распространенным методом обнаружения в ИХ является кондуктометрия [17]. Принцип, основанный на определении электропроводимости, показан на Анимации 3 [2]. Определение электропроводимости позволяет определить, насколько хорошо ионы в растворе проводят электрический ток между двумя электродами, предоставляя информацию о концентрации присутствующих ионов. При сочетании с подавителем фоновый сигнал уменьшается, а чувствительность и отношение сигнал/шум значительно повышаются (Анимация 2) [2,17].

ИХ с кондуктометрическим детектированием имеет широкий спектр применения для фармацевтического анализа, включая:

Особенность ИХ заключается в определении нескольких анионных компонентов (ацетат, хлорид, цитрат и сульфат в инфузионном растворе; АН-Н-051) или катионных  (натрий, калий, кальций и магний в составе капельного кормления; АН-С-022) за один цикл. Благодаря колонкам высокой емкости разделение аналитов возможно даже в самых прочных матрицах [7].

Детектирование в диапазоне UV/VIS 

UV/VIS – оптический метод детектирования, который может быть использован напрямую, косвенно, или с постколоночной дериватизацией. Метод полезен для обнаружения ионов, поглощающих УФ/видимый свет [2,17].

Прямое детектирование в UV-VIS диапазоне используется наряду с определением электропроводимости, например, для определения ионов, которые поглощают ультрафиолет (нитрит, нитрат, органические анионы), чтобы увеличить вероятность их обнаружения в присутствии высоких концентраций неорганических ионов (хлорид, фосфат, сульфат), которые либо не обладают, либо обладают лишь незначительной способностью поглощать УФ-излучение [2].

Принцип этого метода детектирования показан в Анимации 4.

Для непрямого УФ-обнаружения, используются элюенты с высокой поглощающей способностью в видимом или ультрафиолетовом диапазоне спектра (например, фталатные буферы) [17]. Длина волны детектирования выбирается таким образом, чтобы элюент поглощал, а ионы образца — нет. Это приводит к появлению отрицательных пиков, площадь которых прямо пропорциональна концентрации аналита.

Амперометрическое детектирование

Амперометрическое детектирование — это электрохимический аналитический метод, при котором ток, генерируемый при окислении или восстановлении аналитов на рабочем электроде, измеряется как функция времени [20] (Анимация 5). 

Необходимым условием является то, что целевые ионы должны быть способны либо восстанавливаться, либо окисляться, т. е. быть электроактивными веществами [2,17]. Примерами аналитов являются органические соединения, переходные металлы, анионы (например, нитрит, нитрат, сульфид, сульфит) или углеводы [2]. Некоторые примеры использования ИК с амперометрическим обнаружением в фармацевтической промышленности включают определение лактозы (в молочных продуктах и добавках, AN-P-089), катехоламинов (в фармацевтическом инъекционном растворе, AN-P-053), гентамицина (в растворе гентамицина, AN-P-080) и пропиленгликоля (в растворе диклофенака для местного применения, AN-P-076).

Наша работа описывает определение полирибозилрибитолфосфата (PRP) в вакцине Haemophilus influenzae с использованием ИХ с импульсным амперометрическим детектером (Рисунок 4). 

Черная линия на хроматограмме показывает стандарт с концентрацией 3 мкг/мл PRP. Сине-зеленая линия указывает на общее содержание PRP (конечная концентрация 19,42 мг/л), в пределах 80–120% от заявленной на этикетке (16–24 мг/л). Согласно критериям качества, содержание свободного PRP должно составлять менее 20% от общего содержания PRP. Образец (линия лаймово-зеленого цвета на хроматограмме) показывает определенное содержание свободного PRP (конечная концентрация 2,03 мг/л) и соответствует требованиям.

ИХ-встроенная масс-спектрометрия

Ионную хроматографию можно комбинировать с масс-спектрометрией для повышения чувствительности обнаружения органических кислот, углеводов или микроэлементов. Метод обеспечивает гибкость в отношении используемой подвижной фазы и защищает от загрязнений, что особенно важно для определения микроэлементов. ИХ-подавление гарантирует, что жидкость, поступающая в эти высокочувствительные масс-спектрометры, содержит только аналиты и воду (и, возможно, некоторые органические модификаторы). Это полезно для стабильных условий работы, чувствительности анализа и продления срока службы прибора.

Узнайте больше о ИХ с масс-спектрометрией (IC-MS)

Объединение ионной хроматографии и масс-спектрометрии

White paper: Введение в ионную хроматографию-масс-спектрометрию (IC-MC)

Заключение

Ионная хроматография — мощный и универсальный аналитический метод для применения в фарминдустрии. Он способен работать с широким спектром образцов и обеспечивает высокую чувствительность при обнаружении ионных и ионизируемых веществ. Способность объединять различные стратегии обнаружения делает ее бесценной в фармацевтическом производстве и для контроля качества.

Узнайте больше

Монографии: лекарственные средства, анализы и оценки примесей — обновите свои методы USP с помощью ионной хроматографии Metrohm

Flyer: Обновите свои методы USP!

Блог Metrohm: Применение методов, утвержденных USP, для эквивалентности разделительных колонок

White paper: Когда ВЭЖХ не работает: ИХ в анализе пищевых продуктов, воды и фармацевтических препаратов

Запись вебинара: From APIs to impurities and excipients – Ion chromatography for pharmaceutical analysis (От АФИ до примесей и вспомогательных веществ – ионная хроматография для фармацевтического анализа)а

Запись вебинара: Ion chromatography for pharmaceutical applications (Ионная хроматография для фармацевтических применений)

Запись вебинара: Analysis of impurities in pharmaceuticals using ion chromatography (Анализ примесей в фармацевтических препаратах с использованием ионной хроматографии)