Chromatographie ionique pour l'industrie pharmaceutique

La chromatographie ionique (CI) est une technique analytique utilisée pour séparer et quantifier les analytes ioniques et polaires. La CI a été largement acceptée par l'industrie pharmaceutique et les organismes de réglementation pour une gamme élargie d'applications telles que la qualité de l'eau et l'analyse chimique. Ces dernières années, elle s'est qualifiée pour l'analyse des produits pharmaceutiques. L'United States Pharmacopeia-National Formulary (USP-NF, US Pharmacopeia (USP)), l'organisme de normalisation principal pour les produits (bio)pharmaceutiques, a accru le potentiel de l'IC au cours de ses approches de modernisation, en l'établissant comme une technique appropriée et valide dans ses chapitres généraux officinaux, ses essais et ses tests d'impureté. 

Cet article présente brièvement les principes de la chromatographie ionique, puis discute des applications et des avantages de son utilisation pour l'analyse pharmaceutique sur la base du chapitre général de l'USP <1065> Chromatographie ionique.

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• Qu'est-ce que la chromatographie ionique ?
• Pourquoi la chromatographie ionique est-elle importante pour l'industrie pharmaceutique ?
• Techniques de détection d'IC et leurs applications selon USP <1065>

Qu'est-ce que la chromatographie ionique ?

La chromatographie ionique est un type de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) utilisé pour séparer et quantifier simultanément des analytes ioniques et polaires, le plus souvent en utilisant l'échange d'ions comme mécanisme de séparation [1–3] (Animation 1). 

La combinaison de colonnes de séparation à échange d'ions et de détection par conductivité représente la plupart des applications de CI, mais l'utilisation d'autres techniques de détection telles que l'UV/VIS, la détection ampérométrique ou le couplage avec des spectromètres de masse est également courante [3,4]. Les principaux composants d'une installation de chromatographie liquide sont présentés à la figure 1. Ils comprennent une pompe à haute pression avec stockage de la phase mobile (éluant), un injecteur (introduction de l'échantillon), une colonne de séparation (colonne analytique) et le système de détection (y compris la dérivatisation, l'acquisition et le traitement des données).

Pour en savoir plus sur le développement de la chromatographie ionique chez Metrohm et ses nombreuses techniques de détection, consultez ces documents :

Blog : Histoire de Metrohm IC - Partie 1

Monographie : Chromatographie Ionique

Monographie : Chromatographie ionique pratique - Une introduction

Pourquoi la chromatographie ionique est-elle importante pour l'industrie pharmaceutique ?

Même si les approches HPLC dominent les méthodes de chromatographie liquide dans l'industrie pharmaceutique, l'IC est également devenue largement acceptée. Les avantages de la CI par rapport à d'autres méthodes de chromatographie liquide ou à des méthodes traditionnelles telles que le titrage pour l'industrie pharmaceutique peuvent être résumés comme suit [5,6]:

• analyse de plusieurs substances à analyser en une seule fois
• dédié aux analytes ioniques et polaires
• chemin d'écoulement sans métal  
• les éluants sont à base de sels, d'acides faibles ou de bases faibles
• suppression (animation 2) pour une faible ligne de base et un faible rapport signal/bruit, ce qui améliore la sensibilité analytique
• instrumentation flexible : divers détecteurs (par exemple, conductivité, UV/VIS, détection ampérométrique ou couplage avec des spectromètres de masse), degré élevé d'automatisation pour une efficacité maximale et un faible coût de propriété (Par exemple., options de préparation d'échantillons en ligne ou d'étalonnage à norme unique) 

L'IC en tant qu'approche validée pour les normes USP-NF

L'USP-NF, l'un des principaux organismes de normalisation des méthodes pharmaceutiques, garantit la qualité, la sécurité et l'efficacité des produits pharmaceutiques au cours du processus de fabrication et de leur utilisation [6,7]. L'histoire des normes USP-NF est assez longue - plus de 200 ans [6]. Cependant, de nouveaux critères de qualité et de nouvelles technologies ont soutenu une initiative de modernisation globale de la FDA (U.S. Food and Drug Administration) et de l'USP-NF en 2010.

La CI, en tant qu'approche méthodologique pour l'analyse des impuretés à l'état de traces, des excipients, des ingrédients pharmaceutiques actifs (IPA), des métabolites et des produits de dégradation, ainsi que des composants ioniques dans les solutions pharmaceutiques et les fluides corporels [5,8-15], est devenue une approche validée dans de nombreux chapitres de l'USP, essais, tests d'impureté et d'identification. Dans ce cas, la CI a partiellement remplacé les méthodes traditionnelles (par exemple, le titrage) ou a été incluse dans de nouvelles normes axées sur l'utilisation des méthodes de l'état de l'art.

Les principes fondamentaux des techniques chromatographiques sont exposés dans les chapitres généraux de l'USP <621> et <1065> [16,17]. Ces chapitres généraux décrivent les détails de la méthodologie et de la configuration générale, ainsi que les paramètres clés et les exigences en matière de précision et de fiabilité des méthodes chromatographiques dans l'analyse pharmaceutique.

Chapitres généraux de l'USP <621> et <1065> : Principes de base et fondamentaux de la chromatographie

Le chapitre général de l'USP <621> donne une vue d'ensemble de plusieurs techniques chromatographiques ainsi que des définitions de l'appareil et de la procédure (par exemple, phase mobile, colonne, types d'élution, procédure de la méthode), des paramètres communs et des exigences pour les tests d'adéquation du système (par exemple, répétabilité du système, sensibilité du système et performance de pointe) [16]. La classification des colonnes chromatographiques est également expliquée à l'aide d'une liste de garnitures (numéros L), de phases (G) et de supports (S), qui servent de références aux chromatographes [18].

Les nombres L pour les approches USP de chromatographie ionique et les informations sur la procédure d'équivalence de colonne sont expliqués dans l'article ci-dessous.

Blog : Application des méthodes validées par l'USP pour l'équivalence des colonnes de séparation

D'autre part, le chapitre général de l'USP <1065> fournit un aperçu complet de la CI [16,17] et de son importance en tant que procédure d'essai reconnue pour l'identification et la quantification d'analytes spécifiques (essais et impuretés). La chromatographie ionique est une procédure de caractérisation valable dans de nombreuses circonstances et s'aligne sur tous les aspects de la production pharmaceutique [8,17]. Son champ d'application est vaste et comprend le contrôle de la qualité des matières premières, des substances médicamenteuses ou des produits formulés, ainsi que l'évaluation des eaux de traitement utilisées pour la fabrication, des milieux de culture, des solutions de nettoyage ou des flux d'eaux usées [17]. L'USP <1065> comprend les connaissances de base de cette technique : ce qu'est la chromatographie ionique, les détails de l'instrumentation (Figure 1), les mécanismes de détection courants, les procédures et les notes importantes pour le développement d'une méthode appropriée.

Des explications plus détaillées sur les critères et les exigences en matière de validation des méthodes sont données au chapitre général <1225> Validation des procédures officinales. Cela comprend les tests d'adéquation du système pour s'assurer que le système d'IC fonctionne correctement avant l'analyse en évaluant des paramètres tels que la résolution, le temps de rétention et la forme des pics, ainsi que les exigences de validation avec des paramètres clés tels que la linéarité, l'exactitude, la précision, la spécificité, la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) [19]. En général, lors de la mise au point d'une méthode d'IC, il est très important de sélectionner les phases mobiles et stationnaires appropriées (figure 1) pour garantir une séparation efficace et une sélectivité et une sensibilité appropriées (exigences selon USP <1225>) [17,19]. Les phases mobiles sont généralement constituées d'acides, de bases ou de sels dilués dans de l'eau de grande pureté, tandis que les phases stationnaires peuvent être des matériaux à base de silice ou de polymère.

En raison de leur importance, les colonnes et les phases mobiles appropriées sont intégrées dans les monographies et les chapitres généraux de l'USP. Cependant, l'équivalence des colonnes donne aux utilisateurs une certaine liberté pour mettre en œuvre la méthode dans le flux de travail analytique. 

Pour en savoir plus sur les colonnes IC, consultez notre série d'articles de blog, en commençant ici.

Blog : Meilleures pratiques pour les colonnes de séparation en chromatographie ionique (IC) - Partie 1

Techniques de détection d'IC et leurs applications selon USP <1065>

Cette section aborde quatre méthodes de détection des circuits intégrés couramment utilisées (cliquez ci-dessous pour passer d'un sujet à l'autre) :

• détection de la conductivité
• Détection UV/VIS
• détection ampérométrique
• IC avec trait d'union vers la spectrométrie de masse

Détection de la conductivité

La méthode de détection des IC la plus courante est la conductivité [17]. Le principe - basé sur la conductométrie - est illustré dans l'animation 3 [2]. La détection de la conductivité mesure la capacité des ions d'une solution à conduire le courant électrique entre deux électrodes, ce qui fournit des informations sur la concentration des espèces ioniques présentes. Lorsqu'elle est associée à un suppresseur, le signal de fond est réduit, et la sensibilité et le rapport signal/bruit sont considérablement améliorés (Animation 2) [2,17].

L'IC avec détection de la conductivité a une large gamme d'applications pour l'analyse pharmaceutique, y compris :

La particularité de l'IC réside dans la détermination de plusieurs analytes en une seule fois, comme le montre, par exemple, la détermination de plusieurs analytes anioniques (acétate, chlorure, citrate et sulfate dans une solution de perfusion).; AN-N-051) ou pour les composants cationiques (sodium, potassium, calcium et magnésium dans les formules d'alimentation goutte à goutte).; AN-C-022). Grâce à des colonnes IC de grande capacité, la séparation des analytes est possible même dans les matrices les plus résistantes. [7].

Détection UV/VIS

UV/VIS - une technique de détection optique qui peut être utilisée directement,  indirectement ou avec une dérivatisation post-colonne - est utile pour détecter les ions qui absorbent la lumière UV/VIS.

La détection directe UV-VIS est utilisée parallèlement à la détection de la conductivité, par exemple pour la détermination des ions qui absorbent fortement dans la gamme UV (nitrite, nitrate, anions organiques) afin d'améliorer leur détectabilité en présence de concentrations élevées d'ions inorganiques (chlorure, phosphate, sulfate) qui n'ont pas ou peu de capacité d'absorption UV [2]. Le principe de cette méthode de détection est illustré dans l'animation 4..

Pour la  détection indirecte des UV, des éluants ayant une absorbance élevée dans la région spectrale visible ou ultraviolette sont utilisés (par exemple, des tampons de phtalate) [17]. La longueur d'onde de détection est choisie de manière à ce que l'éluant absorbe, mais pas les ions de l'échantillon. Ce choix donne lieu à des pics négatifs qui sont proportionnels à la concentration de l'analyte.

Détection ampérométrique

La détection ampérométrique est une méthode d'analyse électrochimique dans laquelle le courant généré par l'oxydation ou la réduction des analytes sur une électrode de travail est mesuré en fonction du temps. [20] (Animation 5). 

Une condition préalable est que les ions cibles puissent être réduits ou oxydés, c'est-à-dire qu'ils soient des substances électroactives [2,17]. Les composés organiques, les métaux de transition, les anions (par exemple, le nitrite, le nitrate, le sulfure, le sulfite) ou les hydrates de carbone sont des exemples d'analytes [2]. Parmi les exemples d'utilisation de la CI avec détection ampérométrique dans l'industrie pharmaceutique, on peut citer le lactose (dans les produits laitiers et les suppléments, AN-P-089), catécholamines (dans une solution pharmaceutique injectable), AN-P-053), gentamicine (en solution de gentamicine), AN-P-080), et le propylène glycol (dans la solution topique de diclofénac), AN-P-076).

Notre Livre Blanv décrit la détermination du phosphate de polyribosylribitol (PRP) dans un vaccin contre Haemophilus influenzae en utilisant l'IC avec détection ampérométrique pulsée (Figure 4). 

La ligne noire du chromatogramme montre un standard avec une concentration de 3 µg/mL de PRP. La ligne bleue-verte indique la teneur totale en PRP (concentration finale de 19,42 mg/L), qui se situe entre 80 et 120 % de l'étiquette revendiquée (16-24 mg/L). Selon les critères de qualité, le PRP libre doit être inférieur à 20 % de la teneur totale en PRP. L'échantillon (ligne vert lime dans le chromatogramme) présente la teneur en PRP libre déterminée (concentration finale de 2,03 mg/L) et répond aux exigences.

IC avec trait d'union vers la spectrométrie de masse

La chromatographie ionique peut être associée à des spectromètres de masse pour améliorer la sensibilité de détection des acides organiques, des hydrates de carbone ou des oligo-éléments. L'instrumentation inerte garantit la flexibilité de la phase mobile utilisée et protège contre la contamination, ce qui est particulièrement important pour la spéciation des éléments à l'état de traces. La technique de suppression de l'IC garantit que le liquide qui pénètre dans ces spectromètres de masse très sensibles ne contient que des analytes et de l'eau (et éventuellement quelques modificateurs organiques). Ceci est bénéfique pour la stabilité des conditions de fonctionnement, la sensibilité de l'analyse et l'allongement de la durée de vie de l'instrument.

Pour en savoir plus sur le trait d'union de la CI avec la SEP, consultez nos ressources ici :

Trait d'union entre la chromatographie ionique et la spectrométrie de masse

Livre Blanc: Introduction à la spectrométrie de masse par chromatographie ionique (IC-MS)

Conclusion

La chromatographie ionique est un outil analytique puissant et polyvalent pour les applications pharmaceutiques. Elle est capable de traiter une grande variété de types d'échantillons et offre une grande sensibilité lors de la détection de substances ioniques et ionisables. La capacité de la CI à coupler différentes stratégies de détection la rend inestimable dans la fabrication de produits pharmaceutiques et pour le contrôle de la qualité.

Vos connaissances à emporter

Monographies de médicaments, essais et évaluations d'impuretés - Actualisez vos méthodes USP avec la chromatographie ionique Metrohm

Flyer: Actualisez vos méthodes d'USP !

Blog post: Application des méthodes validées par l'USP pour l'équivalence des colonnes de séparation

Livre Blanc : En cas d'échec de la CLHP : IC dans l'analyse des aliments, de l'eau et des produits pharmaceutiques

Webinaire à la demande : Des principes actifs aux impuretés et aux excipients - Chromatographie ionique pour l'analyse pharmaceutique

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