Applicazione di metodi validati USP per l'equivalenza delle colonne di separazione

La Farmacopea degli Stati Uniti (USP) ha iniziato nel 2010 ad aggiornare circa 4300 monografie e 220 capitoli generali con tecnologie moderne [1]. Durante questo periodo, anche la cromatografia ionica (IC) divenne una tecnica analitica più popolare man mano che maturava. Le agenzie di regolamentazione ora considerano l'IC come una tecnologia accettabile per analizzare prodotti farmaceutici e biofarmaceutici.

L’ambito delle analisi IC nel settore farmaceutico è piuttosto ampio. L'IC può valutare tracce di impurità, eccipienti, ingredienti farmaceutici attivi (API) e metaboliti, nonché determinare componenti ionici in soluzioni farmaceutiche e fluidi corporei [2–10]. Questi parametri di controllo della qualità possono essere misurati nelle materie prime, durante il processo di produzione e nei prodotti finali. L'IC è adatto anche per il controllo della qualità delle acque di processo e delle acque reflue, salvaguardando la produzione e garantendo che le acque reflue scaricate soddisfino le normative [2,11–17].

Questo articolo del blog si concentra sull'incorporazione dell'IC durante la modernizzazione dei metodi USP. Viene discussa l'equivalenza delle colonne di separazione e come questa renda i laboratori più flessibili implementando colonne alternative per metodi analitici in conformità con i requisiti USP.

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USP Capitoli e Monografie
USP guida alla validazione cromatografica, alla qualificazione e all'idoneità del sistema
Specifiche e requisiti per analisi farmaceutiche di alta qualità
La colonna analitica: parte essenziale della metodologia
Criteri di accettazione del metodo USP per le colonne
Studi di equivalenza delle colonne Metrohm
L'importanza dell'equivalenza delle colonne per l'analisi farmaceutica

Capitoli generali e monografie USP

L'USP fornisce standard di qualità per farmaci sicuri, sostanze farmaceutiche, integratori alimentari e prodotti alimentari. I presupposti e le definizioni di base sono riepilogati nei capitoli «Avvisi e requisiti generali». Le «monografie» e i «capitoli generali» descrivono procedure di prova e criteri di accettazione o linee guida generali per garantire l'identità, la qualità e la purezza dei prodotti.

Guida USP alla validazione cromatografica, alla qualificazione e all'idoneità del sistema

Il capitolo generale <621> [18] (così come <1065> [19] e <1225> [20]) si concentra sulla validazione e qualificazione dei metodi cromatografici, compreso l'IC. Stabilisce inoltre i requisiti e il quadro per i test di idoneità del sistema.

Le prove di idoneità del sistema sono parte integrante della procedura analitica. Questi test garantiscono prestazioni adeguate del sistema cromatografico. Il rispetto dei criteri di idoneità del sistema è obbligatorio durante tutta la procedura cromatografica. L'analisi di un campione è accettabile solo se è stata dimostrata l'idoneità del sistema.

Specifiche e requisiti per analisi farmaceutiche di alta qualità

Il processo complessivo di validazione e qualificazione di un metodo USP per la determinazione degli analiti descritto nelle Monografie e nei Capitoli Generali è molto complesso e soggiace a rigide linee guida come già accennato.

Le procedure cromatografiche generali specificate in questi metodi USP implicano numerosi dettagli sul sistema e sulle condizioni cromatografiche. Per queste condizioni, i test di idoneità del sistema dimostrano che il metodo cromatografico è robusto e valido per quantificare gli analiti di interesse. Tali test includono misurazioni ripetute di campioni e standard che devono soddisfare i criteri di accettazione e soddisfare i criteri di prestazione del metodo [18,21] come spiegato di seguito:

numero di piatti teorici (N, una misura dell'efficienza della colonna)
fattore di scodamento (chiamato anche fattore di simmetria A_S, una misura dell'asimmetria di picco)
risoluzione (R_S, descrive la qualità di separazione)
deviazione standard relativa - una misura della ripetibilità del sistema calcolata da serie consecutive di misurazioni per non meno di tre, ma fino a sei iniezioni o applicazioni di una soluzione di riferimento

I moderni programmi software cromatografici (ad esempio MagIC Net) facilitano la procedura di calcolo complessiva di questi parametri. Tuttavia, la procedura di validazione completa è rigorosa, laboriosa e molto complessa.

La colonna analitica: parte essenziale della metodologia

Considerando i parametri metodologici, è evidente che la colonna è una parte fondamentale del metodo. Ciò è specificato dalle dimensioni e dall'imballaggio della colonna (o dalla classificazione del gruppo L secondo il database USP).

La tabella 1 elenca alcuni gruppi L rilevanti per l'analisi IC insieme alla loro descrizione ed esempi di colonne Metrohm equivalenti. Questi si trovano nel database delle colonne USP [22] e sono specificati anche nei documenti USP, capitolo «Reagenti» [23].

Tabella 1. Gruppi L di confezionamento delle colonne USP, definizioni, colonne di separazione conformi di Metrohm e monografie USP laddove applicabili.

Packing	Descrizione	Colonna Metrohm conforme	MonografiaUSP
L46	Polystyrene/divinylbenzene substrate agglomerated with quaternary amine functionalized latex beads (diameter 9–11 µm).	Metrosep A Supp 1 - 250/4.6	Voriconazole, Sodium Fluoride and Acidulated Phosphate Topical Solution, Sodium Fluoride Oral Solution, <345> Assay for Citric Acid/Citrate & Phosphate
L76	Silica-based weak cation-exchange material, 5 µm in diameter. Substrate is surface polymerized polybutadiene-maleic acid to provide carboxylic acid functionalities. Capacity not less than 29 µEq/column.	Metrosep C 4 - 250/4.0 Metrosep C 6 - 150/4.0	Calcium Acetate Capsules, Potassium Citrate & Citric Acid Oral Solution, Potassium Bicarbonate Effervescent Tablets for Oral Solution, Potassium and Sodium Bicarbonates and Citric Acid Effervescent Tablets for Oral Solution, Potassium Bicarbonate and Potassium Chloride Effervescent Tablets for Oral Solution (Potassium)
L91	Strong anion-exchange resin consisting of monodisperse porous polystyrene/divinyl benzene beads (diameter 3–10 µm) coupled with quaternary amine.	Metrosep A Supp 10 - 250/4.0 Metrosep A Supp 16 - 100/4.0 Metrosep A Supp 17 - 150/4.0 Metrosep A Supp 19 - 150/4.0	Zinc Oxide, Zinc Oxide Neutral, Zinc Oxide Powder, Zinc Sulfate Ophthalmic Solution, <591> Zinc Determination, Sodium Fluoride, Sodium Fluoride Gel, Sodium Fluoride Oral Solution, Potassium Bicarbonate and Potassium Chloride Effervescent Tablets for Oral Solution, Sodium Fluoride Tablets, Stannous Fluoride, Sodium Monofluorophosphate, Stannous Fluoride Gel, Potassium Phosphates Compounded Injection, Sodium Chloride Tablets for Solution, Sodium Phosphates Compounded Injection
L97	Weak cation-exchange resin consisting of a highly cross-linked core of 5.5 µm porous particles having a pore size of 2000 Å and consisting of ethylvinylbenzene cross-linked with 55% divinylbenzene. Substrate is surface grafted with carboxylic acid functionalized groups. Capacity not less than 2400 µEq/column (4 mm x 25 cm).	Metrosep C Supp 2 - 250/4.0	Sodium Bicarbonate Compounded Injection, Sodium Phosphates Compounded Injection
L105	A strong anion-exchange resin consisting of highly cross-linked 9 µm supermacroporous (2000 Å) particles functionalized with very low cross-linked latex (0.2%) to provide alkyl quaternary ammonium ion sites.	Metrosep A Supp 4 - 250/4.0	Sodium Nitrite

Criteri di accettazione del metodo USP per le colonne

Innanzitutto, la colonna deve essere assegnata a una specifica categoria L. I materiali per ciascun gruppo o categoria L hanno determinate proprietà e determinate caratteristiche fisiochimiche della colonna (vedere la Tabella 1 per gli esempi). Questi devono corrispondere alle proprietà e alla chimica della colonna di separazione in questione. Le categorie del gruppo L possono includere colonne diverse di un singolo fornitore o di diversi produttori.

Se l'USP assegna una singola colonna a un gruppo L, allora le condizioni descritte in una monografia possono essere qualificate (ad esempio, determinazione dell'ossido di zinco secondo USP <591> [24]; AN-U-076) come descritto in precedenza. Il gruppo L è specificato per ciascun metodo IC, non per una colonna particolare. Ciò consente una certa flessibilità all'utente a seconda delle sue preferenze quando seleziona una colonna dello stesso gruppo L per la qualificazione del metodo (Tabella 1).

Equivalenza della colonna

L'equivalenza delle colonne ora consente ai laboratori e ai produttori di qualificare le colonne per metodi cromatografici convalidati. La Figura 1 mostra la procedura generale.

Sono disponibili due opzioni per eseguire il test di equivalenza delle colonne senza la necessità di una convalida completa:

l'utente seleziona una colonna che appartiene allo stesso gruppo L specificato per il metodo completamente convalidato
l'utente seleziona una colonna che appartiene a un gruppo L simile nelle sue caratteristiche fisico-chimiche della fase stazionaria senza alcuna modifica dell'identità del sostituente

Il capitolo generale <621> dell'USP [18] specifica i requisiti per questa procedura insieme ai criteri di idoneità e accettazione del metodo validato per il quale la colonna deve essere qualificata.

Figura 1. Schema illustrato che mostra come le colonne di separazione equivalenti vengono proposte, riviste, approvate e accettate dall'USP.

Studi di equivalenza delle colonneMetrohm

Metrohm è coinvolta nell'esecuzione delle convalide complete del metodo USP. Un esempio è descritto nella nota applicativae AN-S-398: «Phosphate in sodium and potassium phosphates compounded injections».Qui la colonna Metrosep A Supp 17 - 150/4.0 è utilizzata per la determinazione dei fosfati.

Diverse colonne Metrohm (Tabella 1) sono state qualificate per i metodi USP nell'ambito del processo di equivalenza delle colonne. Altri esempi includono la convalida della colonna Metrosep A Supp 4 - 250/4.0 per il dosaggio del nitrito nel nitrito di sodio (AN-S-400) o della colonna Metrosep A Supp 1 per la quantificazione del voriconazolo come mostrato più dettagliatamente di seguito.

Esempio applicativo: analisi del voriconazolo

La colonna Metrosep A Supp 1 è stata qualificata dall'USP per l'analisi del composto correlato al voriconazolo F. Voriconazolo è un farmaco usato per trattare gravi infezioni fungine [25]. La Tabella 2 elenca tutti i requisiti USP e i parametri del metodo, nonché le caratteristiche prestazionali ottenute per lo studio sull'equivalenza delle colonne.

Lo studio è stato condotto con un sistema 940 Professional IC Vario utilizzando soluzioni F RS del composto correlato al voriconazolo. Per i test di idoneità del sistema sono state utilizzate diverse concentrazioni (2,5–5 µg/mL) e composizioni (Tabella 3). Inoltre, è stata testata una soluzione campione di voriconazolo (lotto n.: VZFP22009, Tabella 4).

Tabella 2. Requisiti relativi all'equivalenza delle colonne per il composto F correlato al voriconazolo secondo USP.

Voriconazole Related Compound F as per USP - Summary Table
Parameters	USP Monograph	Metrohm
Eluent (Mobile phase)	Sodium hydroxide solution: 470 g/L of sodium hydroxide in water Mobile phase: methanol, water, and Sodium hydroxide solution (500:1500:0.175)	Same as USP Monograph
Chloride stock solution	86 μg/mL of sodium chloride in water	Same as USP Monograph
Standard stock solution	250 μg/mL of USP Voriconazole Related Compound F RS. Dissolve in 50% of the final volume with methanol and dilute with Mobile phase to volume.	Same as USP Monograph
Standard Solution	5.0 μg/mL of USP Voriconazole Related Compound F RS from the Standard stock solution in a mixture of methanol and Mobile phase (50:50)	Same as USP Monograph
System suitability solution A	5 μg/mL of USP Voriconazole Related Compound F RS from the Standard stock solution and 1.7 μg/mL of sodium chloride in a mixture of methanol and Mobile phase (50:50)	Same as USP Monograph
System suitability solution B	2.5 μg/mL of USP Voriconazole Related Compound F RS from the Standard solution in Mobile phase	Same as USP Monograph
Sample Solution	5 mg/mL of Voriconazole. Dissolve in 50% of the final volume with methanol and dilute with Mobile phase to volume.	Same as USP Monograph
Detection	Conductivity with suppression	Same as USP Monograph: Conductivity with suppression (MSM_ChS)
Column	4 mm × 5 cm guard column and 4 mm × 25 cm analytical column; both packing L46	Metrosep A Supp 1 Guard/4.6 (P/N: 6.1005.340) Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 (P/N: 6.1005.300)
Flow Rate	1.0 mL/min	Same as USP Monograph
Injection Volume	20 µL	Same as USP Monograph
Run Time	not mentioned	60 minutes
Column Temperature	40 °C	Same as USP Monograph

Il sistema IC Metrohm che utilizza la colonna Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 ha soddisfatto i criteri di idoneità USP per l'analisi del composto F RS correlato al voriconazolo (Tabella 3).

Tabella 3. Determinazione dell'idoneità del sistema Metrohm IC rispetto ai requisiti della monografia USP per l'analisi del composto F correlato al voriconazolo (VRC-F).

System suitability (n=6)	USP Monograph	Metrohm
Tailing factor (System suitability solution B)	NMT 2.0 for VRC-F peak	1.219 (PASS)
Relative Standard Deviation (System suitability solution B)	NMT 10.0% for VRC-F ion	2.347% (PASS)
Resolution between VRC-F ion and Chloride ion (System suitability solution A)	NLT 3.5	11.41 (PASS)

Questo studio soddisfaa anche il criterio di accettazione per le analisi dei campioni di voriconazolo (Tabella 4) ed è stato accettato dall'USP. Un esempio di cromatogramma del composto F correlato al voriconazolo è mostrato nella Figura 2.

Tabella 4. Criterio di accettazione USP per l'analisi del voriconazolo con cromatografia ionica.

Voriconazole (Batch No: VZFP22009)	USP Monograph	Metrohm
Mean Sample results: Triplicate Sample preparations (Voriconazole Sample solution)	NMT 0.1%	0.04% (PASS)

Figure 2. Example chromatogram of a USP reference standard for Voriconazole Related Compound F determined with the Metrosep A Supp 1 column.

L'importanza dell'equivalenza delle colonne per l'analisi farmaceutica

I sistemi di cromatografia ionica da laboratorio dedicati possono differire dalle configurazioni convalidate dall'USP. Ciò è dovuto principalmente alle colonne cromatografiche in uso. L'iniziativa di modernizzazione della monografia dell'USP ha ampliato la scelta delle colonne per i ricercatori. Ciò è molto vantaggioso per l’industria farmaceutica.

Gli studi di equivalenza delle colonne consentono di utilizzare colonne analitiche alternative per analisi farmaceutiche di alta qualità. Ciò consente di risparmiare una notevole quantità di tempo e fatica evitando una procedura completa di convalida del metodo di diverse settimane. In definitiva, l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati analitici vengono comunque raggiunte secondo il metodo convalidato.

Metrohm offre diverse applicazioni convalidate USP nonché colonne alternative per metodi USP convalidati approvati da studi di equivalenza di colonne di successo.

[1] The United States Pharmacopeial Convention. Monograph Modernization History. https://www.usp.org/get-involved/partner/monograph-modernization-history (accessed 2023-09-13).

[2] Kappes, S. When HPLC Fails: IC in Food, Water, and Pharmaceutical Analysis. White paper, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2019.

[3] Kappes, S.; Steinbach, A.; Ruth, K. IC: The All-Rounder in Pharmaceutical Analysis. White paper, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2017.

[4] Metrohm AG. Pharmaceutical Analysis: Quality Control of Pharmaceuticals. Brochure, 8.000.5139EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2015.

[5] Subramanian, N. H.; Wille, A. Inline Sample Preparation – An Effective Tool for Ion Analysis in Pharmaceutical Products. Metrohm AG, 8.000.6010.

[6] Metrohm AG. Bring Your USP Methods up to Date! - The Benefits of Metrohm Ion Chromatography for Your Analytics of APIs, Impurities, and Excipients. Brochure, 8.000.5436EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2023.

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[8] Metrohm AG. Quality Control of Dialysis Concentrates; Application Note, AN-D-003; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2022.

[9] Metrohm AG. Qualitative Determination of Anions in Urine to Verify Adulteration; Application Note, AN-S-215; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2005.

[10] Metrohm AG. Mannitol, Rhamnose, Lactulose and Lactose in Blood Serum with Pulsed Amperometric Detection (PAD); Application Note, AN-P-063; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2016.

[11] Metrohm AG. Standard Methods in Water Analysis; Application Bulletin, AB-221; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2015.

[12] Bruttel, A.; Seifert, N.; Läubli, M.; et al. Monograph: Analysis of Water Samples and Water Constituents with Metrohm Instruments, 8.108.5071EN; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2021.

[13] Ruth, K. Measuring Organic Acids and Inorganic Anions with Ion Chromatography Mass Spectrometry. White paper WP-086EN; Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2023.

[14] Metrohm AG. Trace Monitoring in Distilled Water Using Ion Chromatography; Application Note, AN-Q-008; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2015.

[15] Gandhi, J.; Pfundstein, P.; Martin, C.; et al. Monitoring of Iodine- and Gadolinium-Containing Contrast Media in Water Treatment Plants; Technical Poster, 8.000.6085EN; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2012.

[16] Pfundstein, P.; Martin, C.; Schulz, W.; et al. IC–ICP-MS Analysis of Gadolinium-Based MRI Contrast Agents (TA-023); LCGC Asia Pacific, 2011.

[17] Metrohm AG. Wastewater Analysis in Treatment Plants. Brochure, 8.000.5142EN, Metrohm AG, Herisau, Switzerland 2015.

[18] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <621> Chromatography; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

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[20] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. General Chapter, <1225> Validation of Compendial Procedures; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[21] Schäfer, H.; Läubli, M. Monograph Ion Chromatography, 8.108.5077EN; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.

[22] U. S. Pharmacopeia. Chromatographic Columns; USP: Rockville, MD, USA, 2023.

[23] U. S. Pharmacopeia/National Formulary. Reagents; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023.

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[25] ASHP. AHFS® Patient Medication Information™: Voriconazole, 2023.