Best practice per colonne di separazione in cromatografia ionica (IC) – Parte 3

21 mar 2022

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Questo articolo è Parte 3 di una serie.

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Questo è il terzo e ultimo post della nostra serie che fornisce suggerimenti e trucchi sull'uso corretto delle colonne per cromatografia ionica. Nella prima parte, abbiamo discusso principalmente sulle condizioni operative standard e i limiti operativi per le colonne, mentre nel secondo post ci siamo concentrati su argomenti relativi all'applicazione e quali parametri di eluizione possono essere variati per modificare le prestazioni di separazione. Nella conclusione di questa serie daremo un'occhiata più da vicino ai modi per valutare le prestazioni della colonna durante la sua vita e offriremo alcuni suggerimenti per la risoluzione dei problemi che possono aiutarti a risolvere i problemi che potrebbero verificarsi.

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Parametri essenziali della colonna

Iniziamo osservando i parametri principali che possono essere utilizzati per giudicare le prestazioni della colonna. La maggior parte di questi valori di riferimento può essere estratta dal certificato di analisi. I certificati della colonna di separazione possono essere trovati in Metrohm Certificate Finder. La riproduzione periodica del cromatogramma del certificato per verificare le prestazioni della colonna può essere utile per rilevare tempestivamente i cambiamenti nelle prestazioni ed evitare danni irreversibili della colonna.

Metrohm Certificate Finder

Di seguito, considereremo uno per uno i parametri più importanti.

Tempo di ritenzione e capacità della colonna

Il tempo di ritenzione dei singoli analiti è una buona misura della selettività e della capacità della colonna. Quando i tempi di conservazione degli analiti non corrispondono ai tempi di conservazione del certificato, ci sono molte possibili ragioni per questo comportamento.

È possibile che la composizione dell'eluente sia errata, ad esempio perché i componenti dell'eluente non sono presenti nelle concentrazioni corrette. Nel caso in cui la forza dell'eluente sia troppo elevata, i tempi di ritenzione saranno ridotti. Questo fenomeno di solito si verifica per tutti gli ioni contemporaneamente e sposta tutti i picchi più vicini. In tal modo, gli ioni multivalenti vengono accelerati in misura maggiore rispetto agli ioni monovalenti. Questo problema può essere risolto preparando un nuovo eluente con la composizione corretta.

L'eluente potrebbe non essere fresco o non sufficientemente protetto dall'atmosfera circostante, ad esempio con un adsorbitore di CO₂. L'anidride carbonica dell'aria ambiente può modificare la composizione dell'eluente (cioè forza, pH, ecc.) nel tempo e ciò influenzerà i tempi di ritenzione degli analiti. Gli eluenti deboli di idrossido sono particolarmente interessati da questo problema, poiché la forza di eluizione degli ioni carbonato è molto più forte di quella degli ioni idrossido, portando a forti spostamenti nei tempi di ritenzione. Pertanto, gli ioni multivalenti sono più colpiti da questo rispetto a quelli monovalenti. Questo problema può essere risolto preparando un nuovo eluente e utilizzando un adsorbitore di CO₂. Quando si lavora con eluenti di idrossido, è anche importante verificare lo stato della soluzione madre di idrossido poiché può assorbire CO₂ dall'aria. La Figura 1 mostra l'effetto dell'assorbimento di CO₂ dall'aria sui tempi di ritenzione degli anioni comuni.

Alcuni campioni possono contenere costituenti che occupano i gruppi di scambio ionico del materiale della colonna. In tal caso, il numero di gruppi di scambio ionico disponibili sulla colonna viene ridotto rispetto allo stato iniziale, portando a una capacità della colonna apparentemente inferiore e tempi di ritenzione più brevi. A seconda del tipo di contaminante(i), ci sono possibilità di invertire questo effetto e lavarli dalla superficie della colonna. Queste procedure di rigenerazione vengono adattate individualmente alle diverse fasi stazionarie e dovrebbero essere utilizzate come ultima opzione per salvare una colonna.

Le modalità nonché i limiti di funzionamento sono descritti nei rispettivi foglietti illustrativi della rubrica e sono consultabili sul nostro sito web. Consulta il tuo rivenditore Metrohm prima di eseguire una procedura di rigenerazione.

Manuale per Metrosep A Supp 17

Nel caso in cui la contaminazione provenga da uno ione multivalente, di solito è possibile lavarli via sciacquando la colonna con un eluente a concentrazione maggiore. Nel fare ciò, non dimenticare i limiti operativi della colonna, in particolare per quanto riguarda il pH dell'eluente.
A volte, le molecole organiche possono adsorbire alla fase stazionaria della colonna a causa della loro forte affinità con essa. Ciò può portare a un blocco dei gruppi di scambio ionico e a tempi di ritenzione ridotti insieme a una maggiore pressione di esercizio. Quando ciò accade, può aiutare lavare la fase stazionaria con un eluente contenente una frazione di un modificatore organico. Ciò aumenterà l'affinità del contaminante alla fase mobile e aiuterà a staccarlo dalla fase stazionaria.

Solitamente, dopo tale procedura di rigenerazione, è possibile ripristinare la capacità originaria della colonna.

Un modo ancora migliore per prolungare la durata della colonna di separazione è sostituire regolarmente la colonna di protezione. Uno dei suoi scopi è proteggere la colonna di separazione dai contaminanti trattenendoli.

Assicurati di sostituire la colonna di protezione da tre a quattro volte durante la durata della colonna di separazione, o anche più frequentemente quando si tratta di matrici campione molto complesse come coloranti o matrici alimentari. In queste situazioni, suggeriamo di utilizzare Metrosep RP 2 Guard/3.5.

Metrosep RP 2 Guard/3.5

La sovrapposizione del cromatogramma nella Figura 2 mostra l'effetto di una colonna di guardia difettosa sulla forma del picco.

In alcuni casi, la capacità della colonna è ridotta a causa di modificazioni chimiche della fase stazionaria. Ciò accade quando una colonna viene utilizzata in condizioni al di fuori dei limiti operativi, ad esempio situazioni di pH estremo. Condizioni estreme di pH possono alterare i legami chimici dei gruppi di scambio ionico con il substrato delle particelle di base. Questo processo irreversibile porta a una perdita permanente di capacità della colonna. In questo caso, nessuna procedura di rigenerazione può ripristinare la capacità originaria della colonna.

Si noti che questa perdita di gruppi di scambio ionico avviene anche lentamente durante l'uso regolare delle colonne di scambio ionico. La forza del legame chimico dei gruppi di scambio ionico viene testata a fondo durante lo sviluppo delle colonne Metrohm per fornire una lunga durata della colonna.

Piastre teoriche e simmetria dei picchi

Il numero di piastre teoriche (TP) può essere uno strumento utile per valutare lo stato di impaccamento della colonna. Maggiore è il valore TP, migliore sarà l'impaccamento della colonna. Per un giudizio significativo sul letto di impaccamento della colonna, scegli un analita che non eluisca troppo presto nel cromatogramma (questi picchi possono essere influenzati da effetti extra-colonna, in particolare sui sistemi da 2 mm) e che non sia influenzato da interazioni secondarie ( cioè evitare di usare nitrati). Per i cationi, il potassio è una buona scelta, mentre per gli anioni, il solfato è una scelta adatta.

Sebbene le colonne siano impaccate a pressioni superiori alla normale pressione di esercizio, il letto di impaccamento continua a densificarsi ulteriormente per tutta la durata della colonna con l'applicazione continua di fase mobile scorrevole (eluente). Sebbene il letto di impaccamento della fase stazionaria migliori grazie a questo effetto, può anche portare a un volume morto all'ingresso della colonna di separazione. Questo volume morto può essere responsabile dell'ampliamento del picco e della riduzione delle piastre teoriche, in particolare all'inizio del cromatogramma.

Sebbene questo sia un normale processo di invecchiamento della colonna, è possibile rallentarlo prendendosi cura della colonna. Le azioni preventive includono il lento avvio della portata e della temperatura dell'eluente all'avvio, nonché l'arresto corretto e completo della pompa ad alta pressione prima di rimuovere la colonna, poiché le sollecitazioni meccaniche possono essere dannose per il letto di impaccamento. La sostituzione della colonna di guardia può spesso avere un impatto positivo sulle piastre teoriche e sulle forme dei picchi (vedi Figura 2).

I problemi con il letto di impaccamento della colonna spesso diventano visibili anche nei valori del fattore di asimmetria e nelle forme complessive dei picchi. Una facciata più pronunciata e un allargamento del picco possono essere segnali di avvertimento per l'incanalamento nella colonna o nella colonna di guardia. Sfortunatamente, questo tipo di danno sulla colonna è irreversibile e richiede la sostituzione della colonna di separazione.

Prima della sostituzione della colonna, è importante verificare se i problemi sono originati dalla colonna o da un'altra connessione nel sistema IC ogni volta che si osserva un allargamento del picco nel cromatogramma. Assicurati che tutti i capillari nel percorso ad alta pressione abbiano un diametro ≤0,25 mm e che tutti i capillari siano stati installati e collegati correttamente senza volume morto aggiuntivo. I sistemi dotati di colonne di piccolo diametro interno (2 mm, microbore) sono maggiormente interessati dal volume morto rispetto a quelli con colonne da 4 mm. Ciò significa che quando si utilizzano colonne a microforo, è necessario un volume morto inferiore affinché l'effetto di allargamento del picco diventi visibile rispetto a quando si utilizzano colonne da 4 mm.

Pressione della colonna

Un altro parametro importante da controllare regolarmente per tutta la durata della colonna è la pressione del sistema. L'alta pressione è tra i motivi più frequenti che portano alla sostituzione della colonna. Ogni volta che si nota un aumento di pressione, è importante verificare quale parte del sistema IC ne sia la causa.

Se il campione contiene particelle e viene applicata una preparazione del campione insufficiente, le particelle si accumuleranno all'ingresso della colonna di protezione protettiva e alla fine porteranno ad un aumento della pressione del sistema. In questo caso, la colonna di guardia svolge l'uso previsto di protezione della colonna di separazione e deve essere sostituita. Se la colonna di protezione non viene sostituita abbastanza presto, la contaminazione da particolato potrebbe penetrare e caricarsi sulla colonna di separazione. Sebbene non vi sia una procedura di rigenerazione per una colonna di protezione caricata con particelle, le colonne di separazione contaminate da particelle possono essere rigenerate risciacquando la colonna a basse portate nella direzione del flusso inverso.

Nota: queste procedure di rigenerazione potrebbero non avere successo.

Evitare che le particelle vengano iniettate nel percorso ad alta pressione del sistema IC è un buon modo per proteggere le colonne di protezione e separazione. Metrohm fornisce diverse tecniche automatizzate di preparazione dei campioni che si traducono in un impatto positivo sulla durata della colonna. Le tecniche più comuni per questo scopo sono l'ultrafiltrazione in linea (Figura 3) e la dialisi in linea.

Scopri di più sull'ultrafiltrazione in linea Metrohm nel nostro post sul blog correlato.

Quando devo sostituire la membrana filtrante con l'ultrafiltrazione in linea?

Fine-vita colonna

Tutti i parametri sopra descritti dovrebbero essere presi in considerazione per giudicare le prestazioni della colonna (e del sistema IC). Molti di questi parametri possono essere monitorati da vicino nel software MagIC Net in modo che un potenziale problema possa essere rilevato il prima possibile.

Anche se le colonne Metrohm IC sono progettate e prodotte per avere una durata molto lunga, a un certo punto le prestazioni diminuiranno e anche le procedure di rigenerazione potrebbero non essere in grado di ripristinare le prestazioni della colonna richieste per risolvere le esigenze dell'applicazione. Ciò rappresenta la fine della vita della colonna e rende inevitabile la sostituzione della colonna di separazione.

Le colonne di separazione Metrohm non sono riciclabili e possono essere smaltite con i normali rifiuti. Tuttavia, a seconda dei campioni misurati, dei tipi di sostanze chimiche utilizzate e dei rischi associati, potrebbe essere necessario considerare un'opzione di smaltimento adeguata.

Indipendentemente dalla natura del campione, non aprire mai la colonna.

Panoramica sulla risoluzione dei problemi

La tabella 1 fornisce una panoramica di alcune strategie di risoluzione dei problemi quando si esamina il comportamento delle prestazioni delle colonne.

Indicatore	Causa	Misure preventive e correttive
Aumento della contropressione	Particelle sulla colonna di guardia	Sostituire la colonna di protezione.
Particelle sulla colonna di separazione	Sciacquare la colonna di separazione nella direzione del flusso inverso Mettere l'uscita della colonna in un becher. Sciacquare la colonna di separazione per ca. un'ora. Reinstallare la colonna di separazione nella direzione del flusso.
Particelle nel campione	Preparazione del campione, ad esempio, rimuovere le particelle attraverso l'ultrafltrazione in linea
Tempo di conservazione ridotto	Carbonato nell'eluente	L'anidride carbonica dell'aria influisce sull'equilibrio carbonato/carbonato di idrogeno nell'eluente. Un eluente carbonato/carbonato di idrogeno si indebolisce nel tempo; un eluente di idrossido si rafforza. Chiudere sempre ermeticamente i flaconi di eluente e i flaconi contenenti eluente concentrato. Utilizzare sempre un adsorbitore di CO₂.
Bolle d'aria nell'eluente	Le bolle d'aria rendono instabile il flusso dell'eluente. La contropressione è un indicatore di flusso instabile. Dovrebbe rimanere stabile entro un intervallo di ± 0,1 MPa. Disareare la pompa ad alta pressione. Utilizzare un degasatore per eluenti.
Perdita di capacità nella colonna a causa di ioni ad alta valenza	Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi inorganici.
Perdita di risoluzione	Eluente troppo vecchio o prodotto in modo errato	Gli eluenti devono essere preparati al momento. Assicurarsi che siano prodotti correttamente e in particolare che carbonato e acido carbonato non vengano confusi.
Effetto assorbente della contaminazione depositata nella colonna di guardia	Sostituire la colonna di protezione.
Effetto assorbente della contaminazione depositata nella colonna di separazione	Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi organici o inorganici.
Perdita di piastre teoriche	Colonna di guardia contaminata	Sostituire la colonna di protezione.
Colonna di separazione contaminata	Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi organici o inorganici.
Colonna di separazione sovraccarica	La colonna di separazione può essere sovraccaricata da fattori quali un elevato contenuto di sale nella matrice del campione. Diluire il campione. Iniettare meno campione.
Volume morto nel sistema IC	Verificare che tutti i capillari abbiano un diametro ≤0,25 mm; in caso contrario, sostituire i capillari. Verificare che tutti i capillari siano stati installati correttamente. Il processo di installazione è descritto passo dopo passo nella guida multimediale «IC Maintenance».
Asimmetria	Volume morto o contaminazione sulla colonna di guardia	Sostituire la colonna di protezione.
Colonna di separazione contaminata	Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi organici o inorganici.

Conclusione

Questo articolo spiega come valutare e monitorare le prestazioni della colonna IC per tutta la durata della colonna e quali misure possono essere adottate per garantire una lunga durata della colonna. Con ciò, concludiamo ora la serie «Best practice per colonne di separazione nella cromatografia ionica». In caso di ulteriori domande, non esitare a contattare il rappresentante locale di Metrohm IC.