Melhores práticas para colunas de separação em cromatografia iônica (IC) – Parte 3

Esta é a terceira e última postagem de nossa série que fornece dicas e truques sobre o uso adequado de colunas de cromatografia iônica. No primeira parte, discutimos principalmente as condições padrão de operação, bem como os limites operacionais para colunas, enquanto no na segunda postagem, nos concentramos em tópicos relacionados à aplicação e quais parâmetros de eluição podem ser alterados para modificar o desempenho da separação. Na conclusão desta série, examinaremos mais de perto as maneiras de avaliar o desempenho da coluna durante sua vida útil e ofereceremos algumas dicas de solução de problemas que podem ajudar a corrigir problemas que possam surgir. 

Clique em um tópico abaixo para ir diretamente para cada seção:

• Parâmetros essenciais da coluna
• Tempo de retenção e capacidade da coluna
• Placas teóricas e simetria de pico
• Pressão da coluna
• Fim da vida útil da coluna
• Visão geral da solução de problemas

Parâmetros essenciais da coluna

Vamos começar examinando os principais parâmetros que podem ser usados para avaliar o desempenho da coluna. A maioria desses valores de referência pode ser extraída do certificado de análise. Os certificados da coluna de separação podem ser encontrados no Localizador de certificado Metrohm. A reprodução periódica do cromatograma do certificado para verificar o desempenho da coluna pode ser útil para detectar alterações no desempenho cedo e para evitar danos irreversíveis da coluna.
 

Localizador de certificado Metrohm

A seguir, consideraremos os parâmetros mais importantes um por um.

Tempo de retenção e capacidade da coluna

O tempo de retenção dos analitos individuais é uma boa medida da seletividade e capacidade da coluna. Quando os tempos de retenção dos analitos não correspondem aos tempos de retenção do certificado, existem muitas razões possíveis para este comportamento.

Possivelmente, o a composição do eluente está errada, por exemplo, porque os componentes do eluente não estão presentes nas concentrações corretas. Caso a força do eluente seja muito alta, os tempos de retenção serão reduzidos. Este fenômeno geralmente ocorre para todos os íons simultaneamente e aproxima todos os picos. Assim, os íons multivalentes são acelerados numa extensão mais forte do que os íons monovalentes. Este problema pode ser resolvido preparando um eluente novo com a composição correta.

O o eluente pode não ser fresco ou não estar suficientemente protegido da atmosfera circundante, por exemplo, com um CO₂ adsorvedor. O dióxido de carbono do ar ambiente pode alterar a composição do eluente (ou seja, concentração, pH, etc.) ao longo do tempo e isso afetará os tempos de retenção dos analitos. Eluentes hidróxidos fracos são particularmente afetados por este problema, uma vez que a força de eluição dos íons carbonato é muito mais forte do que a dos íons hidróxido, levando a fortes mudanças nos tempos de retenção. Portanto, os íons multivalentes são mais afetados por isso do que os monovalentes. Este problema pode ser resolvido preparando um novo eluente e usando um CO₂ adsorvedor. Ao trabalhar com eluentes de hidróxido, também é importante verificar o estado da solução estoque de hidróxido, pois ela pode absorver CO₂ do ar. figura 1 mostra o efeito do CO₂ absorção do ar nos tempos de retenção de ânions comuns.

Algumas amostras podem conter constituintes que ocupam os grupos de troca iônica do material da coluna. Nesse caso, o número de grupos de troca iônica disponíveis na coluna é reduzido em comparação com o estado inicial, levando a uma capacidade de coluna aparentemente menor e a tempos de retenção mais curtos. Dependendo do(s) tipo(s) de contaminante(s), existem possibilidades de reverter esse efeito e lavá-los da superfície da coluna. Estes procedimentos de regeneração são adaptados individualmente às diferentes fases estacionárias e deve ser usado como última opção para salvar uma coluna.

Os procedimentos bem como os limites de operação estão descritos no respectivo manual da coluna e podem ser encontrados Em nosso site. Consulte seu revendedor Metrohm antes de realizar um procedimento de regeneração.
 

 Manual para Metrosep A Supp 17

• Caso a contaminação seja proveniente de um íon multivalente, geralmente é possível lavá-los lavando a coluna com um eluente de concentração mais alta. Ao fazê-lo, não se esqueça dos limites de operação da coluna, principalmente no que diz respeito ao pH do eluente.
• Às vezes, as moléculas orgânicas podem ser adsorvidas à fase estacionária da coluna devido à sua forte afinidade com ela. Isto pode levar ao bloqueio dos grupos de troca iônica e à redução dos tempos de retenção, juntamente com o aumento da pressão operacional. Quando isso acontece, pode ser útil lavar a fase estacionária com um eluente contendo uma fração de um modificador orgânico. Isto aumentará a afinidade do contaminante com a fase móvel e ajudará a separá-lo da fase estacionária.

Normalmente, após tal procedimento de regeneração, a capacidade original da coluna pode ser restaurada.

Uma maneira ainda melhor de prolongar a vida útil da coluna de separação é trocando regularmente a coluna de guarda. Uma de suas finalidades é proteger a coluna de separação de contaminantes, retendo-os.

Certifique-se de trocar a coluna de proteção três a quatro vezes durante a vida útil da coluna de separação, ou até com mais frequência ao lidar com matrizes de amostras muito complexas, como corantes ou matrizes de alimentos. Nessas situações, sugerimos usar o Metrosep RP 2 Guarda/3.5.
 

Metrosep RP 2 Guarda/3.5

A sobreposição do cromatograma em Figura 2 mostra o efeito de uma coluna de proteção defeituosa no formato do pico.

Em alguns casos, a capacidade da coluna é reduzida devido à modificação química da fase estacionária. Isto acontece quando uma coluna é usada em condições fora dos limites de operação – por exemplo, situações extremas de pH. Condições extremas de pH podem alterar as ligações químicas dos grupos de troca iônica com o substrato da partícula base. Este processo irreversível leva a perda permanente de capacidade da coluna. Neste caso, nenhum procedimento de regeneração poderá restaurar a capacidade original da coluna.

Observe que essa perda de grupos de troca iônica também ocorre lentamente durante o uso regular de colunas de troca iônica. A força da ligação química dos grupos de troca iônica é exaustivamente testada durante o desenvolvimento das colunas Metrohm para proporcionar uma vida útil longa à coluna.

Placas teóricas e simetria de pico

O número de placas teóricas (TP) pode ser uma ferramenta útil para avaliar o estado do empacotamento da coluna. Quanto maior o valor de TP, melhor será o empacotamento da coluna. Para um julgamento significativo do leito de empacotamento da coluna, escolha um analito que não elua muito cedo no cromatograma (esses picos podem ser afetados por efeitos extra-coluna, em particular em sistemas de 2 mm) e que não seja afetado por interações secundárias ( ou seja, evite usar nitrato). Para cátions, potássio é uma boa escolha, enquanto para ânions, sulfato é uma escolha adequada.

Embora as colunas sejam empacotadas a pressões superiores à pressão normal de operação, o leito de empacotamento continua a densificar-se ainda mais ao longo da vida útil da coluna com a aplicação contínua de fase móvel fluida (eluente). Embora o leito de empacotamento da fase estacionária melhore devido a este efeito, também pode levar a algum volume morto na entrada da coluna de separação. Este volume morto pode ser responsável pelo alargamento do pico e redução das placas teóricas, principalmente no início do cromatograma.

Embora este seja um processo normal de envelhecimento da coluna, é possível retardá-lo cuidando bem da coluna. As ações preventivas incluem o início lento da vazão e da temperatura do eluente na inicialização, bem como o desligamento adequado e completo da bomba de alta pressão antes da remoção da coluna, pois o estresse mecânico pode ser prejudicial ao leito de vedação. A troca da coluna de guarda muitas vezes pode ter um impacto positivo nas placas teóricas e nos formatos dos picos (ver Figura 2).

Problemas com o leito da coluna muitas vezes também se tornam visíveis nos valores do fator de assimetria e nas formas gerais dos picos. Mais pronunciado frente assim como alargamento de pico podem ser sinais de alerta para canalização na coluna ou na coluna de guarda. Infelizmente, este tipo de dano na coluna é irreversível e requer a troca da coluna de separação.

Antes da substituição da coluna, é importante verificar se os problemas são provenientes da coluna ou de outra conexão no sistema IC sempre que for observado alargamento do pico no cromatograma. Certifique-se de que todos os capilares no caminho de alta pressão tenham um diâmetro ≤0,25 mm e que todos os capilares tenham sido instalados e conectados corretamente, sem volume morto adicional. Sistemas equipados com colunas de pequeno diâmetro interno (2 mm, microbore) são mais fortemente afetados pelo volume morto do que aqueles com colunas de 4 mm. Isto significa que ao usar colunas de microfuro, é necessário menos volume morto para que o efeito de alargamento do pico se torne visível em comparação com o uso de colunas de 4 mm.

Pressão da coluna

Outro parâmetro importante a verificar regularmente ao longo da vida útil da coluna é a pressão do sistema. A alta pressão está entre os motivos mais frequentes que levam à substituição da coluna. Sempre que for observado um aumento de pressão, é importante verificar qual parte do sistema IC é a causa.

Se a amostra contiver partículas e for aplicada uma preparação insuficiente da amostra, as partículas acumular-se-ão na entrada da coluna de proteção e eventualmente levarão ao aumento da pressão do sistema. Neste caso, a coluna de proteção executa a função pretendida de proteção da coluna de separação e precisa ser substituída. Se a coluna de proteção não for substituída logo, a contaminação por partículas poderá penetrar e ser carregada na coluna de separação. Embora não exista nenhum procedimento de regeneração para uma coluna de guarda carregada com partículas, as colunas de separação contaminadas com partículas podem ser regeneradas enxaguando a coluna a baixas taxas de fluxo na direção reversa do fluxo.

Observe que esses procedimentos de regeneração podem nem sempre ser bem-sucedidos.

Evitar que partículas sejam injetadas no caminho de alta pressão do sistema IC é uma boa maneira de proteger as colunas de proteção e separação. Metrohm fornece diversas técnicas automatizadas de preparação de amostras o que resulta em um impacto positivo na vida útil da coluna. As técnicas mais comuns para esse fim são a Ultrafiltração Inline (Figura 3) e diálise em linha.

Saiba mais sobre a ultrafiltração em linha Metrohm em nossa postagem de blog relacionada.

Quando devo trocar a membrana de filtração pela Ultrafiltração Inline?

Fim da vida útil da coluna

Todos os parâmetros descritos acima devem ser considerados para avaliar o desempenho da coluna (e do sistema IC). Muitos desses parâmetros podem ser monitorados de perto no Programa MagIC Net para que um problema potencial possa ser detectado o mais cedo possível.

Embora as colunas Metrohm IC sejam projetadas e fabricadas para terem vida útil muito longa, em algum momento o desempenho diminuirá e até mesmo os procedimentos de regeneração poderão não ser capazes de restaurar o desempenho da coluna necessário para resolver as necessidades da aplicação. Isto representa o fim da vida útil da coluna e torna inevitável a troca da coluna de separação.

Colunas de separação Metrohm não pode ser reciclado e pode ser descartado com o lixo normal. No entanto, dependendo das amostras medidas, bem como dos tipos de produtos químicos utilizados e dos perigos associados, pode ser necessário considerar uma opção de eliminação adequada.

Independentemente da natureza da amostra, não abra a coluna a qualquer momento. 

Visão geral da solução de problemas

tabela 1 fornece uma visão geral sobre certas estratégias de solução de problemas ao observar o comportamento de desempenho da coluna.

Conclusão

Este artigo explicou como o desempenho da coluna IC pode ser avaliado e monitorado durante toda a vida útil da coluna e quais medidas podem ser tomadas para garantir uma longa vida útil da coluna. Com isso, concluímos agora a série «Melhores práticas para colunas de separação em cromatografia de íons». Se você tiver mais dúvidas, não hesite em entrar em contato com o vendedor local da Metrohm IC.

Suas conclusões de conhecimento

Dicas e truques para colunas IC