Análisis de prebióticos con IC-PAD: Mejorando AOAC 2001.02

22 mar 2021

Artículo

Nuestra alimentación es fundamental para nuestra salud. En los últimos años, ha aumentado el interés por los aditivos alimentarios y los suplementos dietéticos, como los prebióticos como los β-galactooligosacáridos (GOS). La determinación del contenido total de GOS en alimentos y suplementos es esencial para cumplir con los estrictos requisitos de seguridad y etiquetado de alimentos. El método más utilizado para la determinación de GOS total se basa en la hidrólisis enzimática para descomponer las moléculas complejas en carbohidratos simples antes de su análisis cromatográfico. Este artículo describe la ventaja de usar una mejora para Método AOAC 2001.02 usando cromatografía iónica con detección amperométrica (IC-PAD) y automatización completa de muestras después de la hidrólisis enzimática.

¿Qué son los GOS?

Los GOS son cadenas de unidades de galactosa con un extremo de glucosa opcional. A menudo están naturalmente presentes en pequeñas cantidades en varios alimentos y bebidas.

Inicialmente descubiertos como componentes principales de la leche materna humana (presentes hasta 12 g/L), los GOS se agregan como suplemento prebiótico a las fórmulas infantiles. Muestran efectos bifidogénicos, lo que significa que apoyan el crecimiento y el bienestar de las bacterias intestinales no patógenas.

Los suplementos de GOS están disponibles crudos o como polvos o jarabes concentrados y, posteriormente, los fabricantes de alimentos los utilizan para enriquecer los productos de consumo o los venden como suplementos.

Requisitos de etiquetado de GOS

El crecimiento continuo de los mercados globales de prebióticos y GOS es el resultado de una mayor conciencia de los consumidores sobre la alimentación saludable. De manera similar, el aumento de la demanda con respecto a la calidad de los alimentos ha llevado a reglas más estrictas y completas para el etiquetado y la seguridad de los alimentos (p. ej., UE 1169/2011 y UE 2015/2283 ). Por lo tanto, la determinación del contenido total de GOS en los alimentos, suplementos o productos sin procesar es esencial para cumplir con tales requisitos.

Los estudios sobre los efectos en la salud de GOS recomiendan dosis máximas por debajo de 30 g por día, aunque esto es mucho más estricto para fórmulas infantiles. De lo contrario, no existen otros límites con respecto al contenido de GOS en los alimentos o como suplementos nutricionales.

Figure 1. Esquema para la determinación del contenido total de GOS mediante cromatografía iónica con detección amperométrica pulsada (IC-PAD) según AOAC 2001.02 y un método optimizado de Metrohm (en verde). La cromatografía de aniones en AOAC se conoce como HPAEC (cromatografía de intercambio de aniones de alto rendimiento), pero aquí se simplifica al término genérico de IC.

AOAC2001.02

El método más utilizado para medir los GOS totales en productos alimenticios es el método estándar AOAC2001.02. Este método se basa en la extracción de GOS de una muestra seguida de hidrólisis enzimática de los oligosacáridos a monosacáridos y su posterior análisis con cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada.

En la AOAC, la cromatografía de aniones se denomina HPAEC (cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución), pero aquí lo simplificaremos al término genérico de CI.

La clave de AOAC 2001.02 es la comparación de una solución de control con una que ha sido tratada e hidrolizada con una enzima (β-galactosidasa). La enzima cataliza la división de los enlaces glucosídicos e hidroliza los GOS y la lactosa en glucosa y galactosa. Las diferencias de concentración de galactosa libre y lactosa determinadas en estas dos soluciones se utilizan para calcular los GOS totales (Figura 1).

Figure 2. Cromatogramas superpuestos de Bimuno (suplemento prebiótico), sin tratar (negro) y tratado con enzima (naranja).

Mejoras al Método AOAC

La preparación de la muestra para AOAC 2001.02 es bastante compleja: una deficiencia es la incubación de la solución de referencia con la enzima desactivada (que es bastante costosa) para determinar las concentraciones iniciales de carbohidratos (Figura 1) en lugar de utilizar el extracto puro. Otro punto crítico es el procedimiento de dilución de la muestra, que se supone que debe realizarse en acetonitrilo, mientras que los estándares se basan en agua ultrapura.

Aquí, el enfoque fue simplificar todo el procedimiento para aumentar la facilidad de uso y la eficiencia general del método.

El método mejorado para el análisis del contenido total de GOS utiliza el extracto para medir las concentraciones iniciales de glucosa, galactosa y lactosa (Figura 1 Ensayo 1). Sin embargo, no se utilizó la enzima desactivada y, en su lugar, se realizaron comparaciones para ver si su presencia tenía algún efecto sobre los resultados. Este paso se eliminó después de obtener resultados equivalentes al Ensayo 1 de la AOAC 2001.02 (con la enzima desactivada), pero se reducen los gastos químicos y el trabajo manual adicional. Por lo tanto, el contenido total de GOS se calcula a partir de las concentraciones de analito en el Ensayo 1 (sin ninguna enzima) y el Ensayo 2 (extracto con la enzima activa) (Figura 2).

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Etiquetas de calidad para nuevos alimentos: mejora de la AOAC 2001.02: análisis de GOS con IC-PAD

Además del uso de enzimas, el método oficial de la AOAC para el análisis de los GOS totales sugiere que los estándares se preparen en agua ultrapura (UPW) mientras que las muestras se diluyen con acetonitrilo al 20 %. Se realizó un experimento de control para comparar los resultados entre:

diluciones en UPW evaluado con UPW calibración (“opción UPW”)
diluciones en acetonitrilo evaluado con UPW calibración (AOAC 2001.02)
diluciones en acetonitrilo evaluado con acetonitrilo calibración (“opción ACN”)

La reproducibilidad del contenido total de GOS se comparó entre las tres opciones, con el Exhibición de opciones de preparación UPW y AOAC resultados similares. La opción de ACN resultó en contenido total de GOS más bajo que los demás. Además, el acetonitrilo no pareció otorgar un efecto estabilizador al muestras Esto apoya la mejora de la AOAC método por realizar diluciones de muestra con UPW en lugar de acetonitrilo, ahorrando reactivos innecesarios y limitando la huella química del análisis.

Resultados

En general, la variabilidad satisfactoria, las recuperaciones de objetivos y picos, junto con las pruebas de interferencia demostraron que el método modificado era valioso y robusto. Con límites de detección (LOD) de 0,1 mg/L (galactosa) y 0,2 mg/L (glucosa, lactosa) en solución, incluso El bajo contenido total de GOS se puede determinar con alta precisión..

Resumen

Como método multicomponente, la cromatografía iónica con detección amperométrica es un método de análisis muy selectivo, sensible y robusto para carbohidratos sin ningún paso de derivatización adicional. En combinación con el tratamiento enzimático, se pueden cuantificar carbohidratos aún más complejos.

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Esta investigación presenta una actualización del método estándar de la AOAC para la determinación del GOS total en alimentos. Con el mismo principio (hidrólisis enzimática de moléculas GOS complejas seguida de análisis cromatográfico de carbohidratos simples), se mejoró la eficiencia del método analítico a favor del tiempo de laboratorio y los costes de funcionamiento. Pasos de automatización adicionales (p. ej., Metrohm Inline Dilution y calibraciones automáticas) puede mejorar aún más la eficiencia del método.

¿Quiere más información sobre el método simplificado para GOS totales a través de IC-PAD? Más detalles sobre la mejora del método AOAC 2001.02 por reducción del trabajo manual de laboratorio y eliminando reactivos caros se puede encontrar en nuestro artículo publicado en La columna de LC/GC (2021): Mejoras en AOAC 2001.02: Determinación de GOS en alimentos usando HPAEC-PAD.