Alamar Blue（別名：レサズリン）は、その光学的特性により、細胞生存率や細胞毒性試験において広く使用される酸化還元インジケーターです。Alamar Blueは弱く蛍光を発する青色染料であり、還元型（レゾルフィン）は高い蛍光を発するピンク色の染料です。
蛍光分光電気化学は、酸化還元反応を追跡し制御するための強力な手法を研究者に提供します。この技術により、電子移動や化学反応中に生成される中間生成物の存在など、さまざまなプロセスを研究することが可能になります。
この技術資料では、電気化学的プロセス中にAlamar Blueの特徴的な蛍光を監視する方法を説明し、このシステムに関する完全な知識を得るための手法を紹介しています。
レサズリンの分光電気化学実験は、分光電気化学装置 SPELECを使用しておこないました。この装置は、電気化学（バイポテンショスタット/ガルバノスタット）および分光学的コンポーネント（UV-Vis光源および検出器）を組み合わせたポータブルシステムとなっています。SPELECは200 nmから900 nmの波長範囲を持つ光源を搭載していますが、励起光源として395 nmのLED（LEDVIS395）が使用されました。このLEDは光の放出範囲が明確に定義されており、Alamar Blueが蛍光を発する波長帯域での光の寄与を避けることができます。
その他の部分は、反射プローブ（RPROBE-VIS-UV）、薄層流動セルスクリーンプリント電極（TLFCL-REFLECELL）用の分光電気化学反射セル、蛍光キット（FLKIT）に含まれるコンポーネントで構成されています。FLKITには、2本の短い光ファイバー（600 μm）、2つの光学フィルター（1つは230–500 nmの波長をフィルタリングし、もう1つは300–750 nmの波長をフィルタリング）、フィルター用の2つのホルダーが含まれています。装置全体の構成は図1に示されています。
薄層フローセル統合スクリーンプリント円形炭素電極（TLFCL110-CIR）は、三電極システムを備えた電気化学セルを含む平らなセラミックカードで構成されています（4 mm直径の円形炭素作業電極、炭素対極、および銀擬似参照電極、図2）。この電極プラットフォームは、溶液の厚さを400 μmに制限するチャネルを備えたスライドで覆われています。
SPELECでは、分光電気化学データが得られ、収集したデータの適切な処理および分析を行うツールを含む専用ソフトウェア「DropView SPELEC」によって管理します。この実験で使用されたすべてのハードウェアおよびソフトウェアは、表1にまとめられています。
| 装置 | 製品番号 |
|---|---|
| 分析装置 | SPELEC |
| 反射プローブ | RPROBE-VIS-UV |
| 励起光 | LEDVIS395 |
| 蛍光キット | FLKIT |
| 薄層フローセル分光電気化学反射セル Flow-Cell SPE | TLCFL-REFLECELL |
| 薄層フローセル分光電気化学ケーブル | CAST-TLFCL |
| 薄層フローセル分光電気化学セル | TLFCL110-CIR |
| ソフトウェア | DropView SPELEC |
Alamar Blueは弱い蛍光を持つ分子で、還元されると強い蛍光を持つピンク色の染料であるレゾルフィンに不可逆的に変化します。しかし、レゾルフィンが強い還元条件にさらされると、可逆的に無色で蛍光を発しないジヒドロレゾルフィンに変換されます。酸化還元反応は図3に示されています。
0.001 mol/LのAlamar Blueの電気化学的還元は、0.1 mol/LのKCl水溶液中で行われました。蛍光の発光は、電気化学信号と同時に記録され、実験中の電極表面で行われた電気化学的プロセスに関するデータが得られました。
このシステムについてできるだけ多くのデータを得るために、三つの異なる電流パルスを適用した多重パルスクロノアンペロメトリー実験をおこないました。最初のステップでは、-0.45 Vの電位が300秒間適用され、Alamar Blueがレゾルフィンに還元されました。次に、-1.00 Vの電位が300秒間適用され、レゾルフィンがジヒドロレゾルフィンに還元されました。最後に、-0.10 Vの電位が300秒間適用され、前のステップで生成されたジヒドロレゾルフィンが再びレゾルフィンに酸化されました。
前のセクションで説明した多重パルスクロノアンペロメトリー実験の最初のステップでは、-0.45 Vを300秒間適用することにより、Alamar Blueの不可逆的な還元が行われました。蛍光の発光は、電気化学信号と同時に記録され、0.75秒ごとにスペクトルが取得されました。図4aには電気化学信号（灰色の線）が示されており、測定中に記録された蛍光スペクトルは図4bに示されています。ここでは、590 nmに中心を持つ発光帯が明確に区別されています。レゾルフィンの分光特性に基づくと、この発光帯はこの分子に特有のものです。
図4aでは、590 nmに中心を持つ蛍光バンドの時間経過に伴う変化（緑の線）も示されています。オペランド測定により、実験全体を通して分光情報を取得することができます。蛍光信号は実験開始時から増加し、その後、Alamar Blueが完全にレゾルフィンに還元される200秒から実験終了時まで一定となります。-0.45 Vの電位はAlamar Blueをレゾルフィンに還元するのには十分ですが、レゾルフィンをジヒドロレゾルフィンに還元するには不十分です。
レゾルフィン（前のステップで生成された）をジヒドロレゾルフィンに還元するために、次の電位パルスとして-1.00 Vを300秒間適用しました。図5aには、電気化学信号（灰色の線）と、590 nmでの蛍光バンドの時間経過（緑の線）が示されています。図5bには、この第二ステップ中に記録された蛍光スペクトルが示されています。
最初のステップの終了時（図4a、緑の線）では、590 nmでの発光バンドの強度は完全に安定していましたが、第二ステップでは、-1.00 Vの電位が適用されると、この発光バンドが100秒間で急激に減少することが示されています。その後の実験中では蛍光は検出されず、レゾルフィン（高い蛍光を持つ）がジヒドロレゾルフィン（蛍光を持たない分子）に完全に還元されたことが示されました（図3）。
最後に、第二ステップで生成されたジヒドロレゾルフィンを再酸化してレゾルフィンに戻すことを目的として、第三の電位ステップが適用されました。図6aには、-0.10 Vが300秒間適用された際の電気化学信号（灰色の線）と、590 nmに中心を持つ蛍光バンドのスペクトルの進化（緑の線）が示されています。このグラフは、光学信号がクロノアンペロメトリー実験の最初のパルスで得られた蛍光値に達することを示しており、図4aに示されています。
図6bに示されたスペクトルの進化は、590 nmに中心を持つ蛍光バンドの増加を確認しています。ジヒドロレゾルフィンは完全に酸化されてレゾルフィンに戻され、実験の最初のステップで観察された蛍光最大値（図4b）と同じ値が第三ステップでも得られました。したがって、レゾルフィンとジヒドロレゾルフィンの間の酸化還元過程の可逆性が明確に示されています。
分光電気化学は、電気化学と分光学の利点を組み合わせることによって異なる性質の情報を提供する強力な技術です。本研究では、異なる電位でのアルマーブルーに関連する蛍光信号を分析しました。-0.45 Vの電位でこの分子を還元してレゾルフィンを生成すると、蛍光信号が強化されます。さらに、-1.00 Vでレゾルフィンをジヒドロレゾルフィンに還元すると、還元種の特性により光学信号が減少します。最後に、ジヒドロレゾルフィンの再酸化によりレゾルフィンに戻り、蛍光信号が増加し、この電気化学的プロセスの優れた可逆性を示します。このメカニズムを理解することは、アルマーブルーの新しい用途、例えば細胞生存性指標としての使用のための新しい応用の開発に新たな可能性を開きます。
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- O’Brien, J.; Wilson, I.; Orton, T.; et al. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity, Eur. J. Biochem. 2000, 267, 5421. https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2000.01606.x
- Twigg, R.S.; Oxidation-Reduction Aspects of Resazurin, Nature. 1945, 155, 401. https://doi.org/10.1038/155401a0
AN-FLU-001 Fluorescence spectroelectrochemistry of [Ru(bpy)3] 2+/3+ in semi-infinite diffusion regime
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