AN-P-089
2022-02
Lactoseintoleranz und Vertrauen in die Richtigkeit der Lebensmittelkennzeichnung
Schnelle und robuste Analyse von Lactose in geringen Mengen mit IC-PAD
Zusammenfassung
Milch und Milcherzeugnisse sind weltweit eine wichtige Nahrungsquelle für den Menschen [1]. Neben Nährstoffen, Mineralien, Proteinen und Fett ist Lactose ein wichtiger Bestandteil von Milchprodukten und dient als Energiequelle. Um Lactose effizient zu verstoffwechseln, ist das Enzym Lactose unerlässlich [2]. Weltweit sind jedoch fast 70 % der Bevölkerung lactoseintolerant, d. h., sie haben Schwierigkeiten, Lactose zu verdauen [3, 4]. Die Lactosemalabsorption führt zu zahlreichen gastrointestinalen und extraintestinalen Symptomen und anderen Beschwerden in unterschiedlichem Ausmaß. Obwohl manche Menschen mit Lactoseintoleranz bereits auf kleinste Mengen empfindlich reagieren, vertragen andere eine geringe Menge ohne negative gesundheitliche Auswirkungen. Bislang gibt es keine spezifischen Grenzwerte oder Vorschriften für die Kennzeichnung und Produktion von lactosefreien Produkten. Daher müssen Lebensmittel mit Hilfe empfindlicher Standardtechniken genau analysiert und gekennzeichnet werden. Die Ionenchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (IC-PAD) ermöglicht die Bestimmung von sehr niedrigen Lactosegehalten. Die Validierung gemäß den AOAC-Anforderungen zeigt die hohe Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit dieser Methode für die Routineanalyse.
Probe und Probenvorbereitung
Die Lactosebestimmung wurde für eine breite Auswahl an Probenmatrizes durchgeführt, darunter Säuglingsanfangsnahrung und Folgebabynahrung (AN-P-088), zertifizierte Referenzproben (z. B. die lactosearme Referenzmilch muva ML-2312) sowie 15 im Handel erhältliche lactosearme und lactosefreie Produkte, darunter Joghurt, Butter, Sahne, Hüttenkäse, Milchgetränke, Milchschokolade und Nahrungsergänzungsmittel.
Feststoffe (z. B. Käse und Milchschokolade) wurden zerkleinert, während die pulverförmigen und flüssigen Stoffe homogenisiert wurden. Nach dieser Vorbehandlung wurden die Proben direkt in geeignete Gefäße (0,1-5 g, 50 mL Polypropylenröhrchen) eingewogen. Das Probengewicht (WS in g) wurde für spätere Berechnungen auf 0,001 g genau notiert. Ein wässriger Extrakt wurde durch Zugabe von Reinstwasser (UPW) auf ein Gesamtvolumen von 50 mL (WUPW in kg) hergestellt. Anschließend wurden die Fläschchen verschlossen und mit einem Vortex-Mixer etwa 20 Sekunden lang kräftig gemischt. Um die Löslichkeit bestimmter Proben (z. B. Frischkäse oder Schokolade) zu verbessern, wurden die Fläschchen 10 Minuten lang in einem auf 70 °C temperierten Wasserbad erhitzt.
Um das Analysensystem zu schützen, ist die Carrez-Fällung eine Standardmethode zur Entfernung von Proteinen und größeren Molekülen. Hierfür wurde den Proben die Carrez-Reagenzien hinzugegeben und das Endgewicht notiert (WUPWc in kg). Nach gründlichem Mischen wurden die Proben 10 Minuten lang zentrifugiert (5000×g) und dekantiert. Die abgedeckten Fläschchen wurden direkt in den Autosampler gestellt. Ein erhöhter Säulenschutz kann durch eine zusätzliche Ultrafiltration der Proben erreicht werden.
Alternativ kann zur automatischen Probenvorbereitung die Inline-Dialyse mit Low Volume Dialysezelle eingesetzt werden. Dabei werden die Proben wie zuvor beschrieben als wässrige Extrakte vorbereitet, gut geschüttelt und abgedeckt, bevor sie direkt auf den Autosampler gestellt werden. Bei Verwendung der Dialyse ist keine Carrez-Fällung vor der Analyse erforderlich, wodurch Zeit und Chemikalien gespart werden. Bei Verwendung der Low-Volume-Dialysezelle werden nur 5 mL der Probe pro Analyse benötigt.
Versuchsdurchführung
Die Konzentration an Lactose in den wässrigen Probenextrakten wurde mit Hilfe der Ionenchromatographie (IC) bestimmt. Die Trennung erfolgte auf einer Metrosep Carb 2 - 250/4.0 Trennsäule unter Verwendung eines isokratischen Hydroxid-Eluenten (400 mmol/L NaOH) und gepulste amperometrische Detektion (PAD) mit der Sweep-Wellenform (AN-P-088, WP-077). Eine lange Elektrodenlebensdauer bei minimalem Wartungsaufwand ist durch den Einsatz der amperometrischen Thin-Layer-Zelle von Metrohm (Au-Arbeits- und Pd-Referenzelektrode) möglich. Der Sweep-Modus in Kombination mit der weniger turbulenten Strömung in der Thin-Layer-Zelle führt zu einer glatten Basislinie mit geringem Rauschen - eine notwendige Voraussetzung für die Analyse sehr niedriger Konzentrationen, wie z.B. in lactosearmen Produkten.
Die Flussschemata für die direkte Analyse von Lactose mit obligatorischer Probenvorbereitung wie der Carrez-Fällung sind in Abbildung 1 dargestellt.
Die Probenstabilität kann mit dem Einsatz eines 889 IC Sample Center - cool verbessert werden. Die automatisierte Probenvorbereitung mittels Inline-Dialyse kann zu jeder bestehenden Konfiguration hinzugefügt werden. Weitere Details finden Sie in der Metrohm-Literatur zur Metrohm Inline-Probenvorbereitung sowie im Application Note AN-P-088.
Mit dem Dosino von Metrohm, das flexibelste Gerät für Liquid Handling, ist die Automatisierung aller Liquid-Handling-Prozesse, ob für den Transport von Proben oder die Reinigung des Probenwegs, möglich.
Ergebnisse und Diskussion
Lactose eluiert in weniger als 30 Minuten (Abbildung 2-6). Der Gesamtarbeitsbereich der Methode liegt bei 0,05 bis 80 mg/L für flüssige Lactosestandards (Abbildung 2 A), mit der Möglichkeit, Proben in einem Bereich von 0,2 bis 21.000 mg/100 g mit entsprechender Verdünnung zu analysieren. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten chromatographischen Methoden konnten Lactosederivate (Epilactose, Lactulose, Allolactose und Galactosyllactose), z. B. aus präbiotischen Zusatzstoffen, erfolgreich von Lactose getrennt werden, was die Selektivität und Genauigkeit der Methode erhöht (Abbildung 2 B).
Die Probenkonzentrationen werden anhand der linearen Kalibrierung bestimmt (c(Lactose)S in mg/kg) (Abbildung 2 A) und zur Bestimmung des endgültigen Lactosegehalts (c(Lactose)FIN in g/ 100 g) auf der Grundlage des Probengewichts berechnet:
Fazit
Die beschriebene IC-PAD-Methode zur Lactosebestimmung in lactosearmen und lactosefreien Milchprodukten erfüllt die AOAC-Einzellabortest-Kriterien. Dies beweist ihre Zuverlässigkeit, Empfindlichkeit und Robustheit. Eine Vergleichsanalyse zur Probenvorbereitung mit Carrez-Fällung und Metrohm-Inline-Dialyse zeigte eine hervorragende Übereinstimmung. Als zeiteffiziente Alternative zur Carrez-Fällung empfiehlt sich die Metrohm-Inline-Dialyse. Metrohm IC-Systeme zeichnen sich durch ein hohes Maß an Flexibilität aus. Die Systeme können zum Beispiel mit einer Inline-Verdünnung aufgerüstet werden. Damit ist es möglich neben einer automatischen Verdünnung auch eine Inline-Kalibrierung und logische Verdünnung durchzuführen. Die Automatisierung vereinfacht die Methode für den Anwendenden und ist besonders für Analysen mit hohem Durchsatz und Routineanalysen geeignet.
Referenzen
- Muehlhoff, E.; Bennett, A.; McMahon, D. Milk and Dairy Products in Human Nutrition; FAO: Rome, 2013.
- Monti, L.; Negri, S.; Meucci, A.; Stroppa, A.; Galli, A.; Contarini, G. Lactose, Galactose and Glucose Determination in Naturally “Lactose Free” Hard Cheese: HPAEC-PAD Method Validation. Food Chem 2017, 220, 18–24. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.09.185.
- Bayless, T. M.; Brown, E.; Paige, D. M. Lactase Non-Persistence and Lactose Intolerance. Curr Gastroenterol Rep 2017, 19 (5), 23. https://doi.org/10.1007/s11894-017-0558-9.
- Facioni, M. S.; Raspini, B.; Pivari, F.; Dogliotti, E.; Cena, H. Nutritional Management of Lactose Intolerance: The Importance of Diet and Food Labelling. Journal of Translational Medicine 2020, 18 (1), 260. https://doi.org/10.1186/s12967-020-02429-2.
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Interne Referenz: AW IC CH6-1435-022021